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第一章 病毒的形态与结构及电镜鉴定原则1

第一节 病毒的大小与形态1

一、病毒的大小概念1

第一篇 病毒学基础知识1

二、病毒的形态特征2

第二节 病毒的结构与功能2

一、病毒的基本结构与功能2

二、病毒的特殊结构与功能3

第三节 病毒结构的对称性4

一、立体对称型病毒4

二、螺旋对称型病毒5

三、复合对称型病毒5

第四节 病毒的电镜鉴定标准和脊椎动物病毒的分类原则5

一、超级寄生的定义与原理21

二、超级寄生律的应用举例21

第一节 病毒的超级寄生律21

第二章 病毒的生活规律及其利用与控制21

第二节 病毒的自我复制繁殖律23

一、病毒繁殖的基本过程23

二、DNA病毒的繁殖机理24

三、单股正链小RNA病毒的繁殖机理25

四、单股负链大RNA病毒的繁殖机理26

二、病毒的人工定向变异27

一、病毒遗传与变异的基本特点27

第三节 病毒的遗传与变异律27

第三章 病毒的致病与免疫原理29

第一节 病毒的致病特点29

一、引起细胞破坏与死亡29

二、致使细胞呈持续感染状态30

三、导致细胞转化与癌变31

第二节 病毒的免疫特点31

一、机体抗病毒的胞外免疫力31

一、干扰素的定义与各类33

第三节 干扰素的基本概念33

二、机体抗病毒的胞内免疫力33

三、两种免疫的强度与持久性33

二、干扰素的基本特性34

六、冠状病毒科(Coronaviridae)34

三、干扰素诱生剂简介35

四、干扰素的产生机理36

五、干扰素的抗病毒机理36

第四章 病毒的分类现状38

第一节 分类基础与概要38

一、分类基础38

二、分类概要38

第二节 DNA病毒类(门)39

一、微病毒科(Parvoviridae)39

二、乳多空病毒科(Papovaviridae)39

第三节 RNA病毒类(门)40

一、小RAN病毒科(Picornaviridae)40

五、痘病毒科(Poxviridae)40

四、疱疹病毒科(Herptoviridae)40

三、腺病毒科(adenoviridae)40

二、呼肠孤病毒科(Reoviridae)41

三、虫媒病毒群(Arbovirus)41

四、披盖病毒科(Togaviridae)41

五、嵌沙样病毒科(Arenaviridae)42

十、副粘病毒科(Paramyxoviridae)43

九、正粘病毒科(Orthomyxoviride)43

八、本雅病毒科(Bunyaviridae)43

七、逆转录病毒科(Rotroviridae)43

十一、弹状病毒科(Rabdoviridae)44

十二、未分类的主要病毒44

十三、类病毒(Viroid?)44

第二篇 病毒的血清学诊断方法45

第五章 补体综合试验方法45

第一节 鼠脑内繁殖病毒法45

一、干燥毒株鼠脑内传代繁殖法45

二、感染小白鼠的观察46

一、感染小白鼠的饲养管理46

第二节 感染小白鼠的饲养观察及取脑方法46

二、低温保存感染鼠脑悬液的制备及鼠脑内传代繁殖法46

三、感染鼠脑剖取法47

第三节 抗原制备方法47

一、丙酮-乙醚浸提法47

二、待检血清制备法50

第五节 羊血球及溶血素的制备与滴定法50

一、羊血球制备法50

二、溶血素制备法51

三、溶血素滴定法52

五、溶血素应用液的配制法53

四、溶血素单位的判定与保贮53

一、补体制备法54

第六节 补体的制备与滴定法54

二、补体滴定法54

第七节 抗原滴定法56

一、方阵滴定法56

第四节 免疫血清与待检血清制备法59

二、蔗糖-丙酮浸提法59

二、“直线”滴定法59

第八节 补体综合试验59

一、补体结合试验程序59

二、补体结合试验方法59

一、免疫血清制备法59

一、抗原浸提与稀释用液的配制63

二、红血球保存液的配制63

第六章 血凝与血凝抑制试验方法63

第一节 试验前的各项准备工作63

三、不同PH血球稀释液的配制64

四、白陶土处理法64

五、血清处理法65

六、血凝素抗原制备法65

七、鹅血球悬液的制备法66

二、血凝与血凝抑制试验的操作方法与技术67

一、血凝及血凝抑制试验程序67

第二节 试验方法与技术67

第三节 血凝与血凝抑制试验方面的几个主要问题75

一、各种病毒的血凝特点75

二、几种虫媒病毒的血凝特点75

三、乙脑病毒血凝与血凝抑制特点76

第七章 中和试验方法80

第一节 试验前病毒LD50测定80

一、病毒悬液制备及稀释法80

二、小白鼠接种及观察法81

三、半数致死量(LD50)计算法81

第二节 流乙脑炎病毒小白鼠中和试验83

一、流乙脑炎病毒小白鼠中和试验程序83

二、流乙脑炎病毒小白鼠中和试验法84

三、小白鼠脑内感染法85

四、观察结果及计算方法85

二、组织培养中和试验86

一、主要影响因素86

第三节 应注意的几个问题86

第三篇 病毒的细胞培养实验技术88

第八章 细胞培养器材处理法88

第一节 玻璃器材处理法88

一、处理方法88

二、注意事项88

一、橡皮塞处理法89

二、解剖器械处理法89

第二节 橡皮塞及解剖器械处理法89

第九章 平衡盐溶液的基本知识及配制方法90

第一节 平衡盐溶液的基本知识90

一、平衡盐溶液的种类与作用90

二、实际用途及配制要求90

第二节 常用平衡盐溶液的配法90

一、Hanks 平衡盐溶液配制法90

二、Earle s平衡盐溶液配制法91

二、小量配制法93

一、大量配制法93

第一节 0.5%酚红配制法93

第十章 细胞培养常用试液配制法93

第二节 7.5%NaHCO3配制法94

第三节 0.2%中性红配制法94

第四节 抗生素配制法94

一、青链双抗配制法94

二、卡那霉素配制法94

三、二性霉素乙配制法94

第五节 1%胰蛋白酶配制法95

第六节 0.02%乙二胺四乙酸二钠溶液配制法95

第七节 血液的作用及选择与注意事项95

一、血清的作用95

二、血清的选择95

三、注意事项95

二、储存液配制方法96

一、基本原理与原则96

第十一章 常用培基原理及其配制法96

第一节 Fagle s培基的基本原理及配制法96

三、储存液分装与保存法97

四、应用液稀释法97

一、基本原理97

第三节 RPMI-1640培基配制98

二、配法98

一、来源98

二、配制方法98

第十二章 单层细胞培养法99

第一节 鸡胚纤维母细胞培养法99

第二节 地鼠肾细胞培养法100

第三节 原代人胚肌皮细胞培养法100

第四节 猪肾细胞传代培养法101

第五节 培养细胞的传代及液氮保贮与复苏法101

一、传代101

一、病毒感染细胞的分布规律102

第一节 病毒感染细胞的分布及滴度计算102

第十三章 病毒在细胞上的感染性滴定102

二、液氮保贮102

三、复苏102

二、病毒感染细胞的三种情况103

三、病毒样品感染滴度的侧定104

第二节 病毒的空斑形成试验105

一、基本概念105

二、材料准备106

三、操作方法106

四、结果观察与计算106

五、注意事项107

第三节 病毒的细胞致病效应实验(微量试验法)107

一、基本概念107

二、实验方法108

三、观察结果108

第十四章 水泡性口炎病毒及新城鸡瘟病毒的增殖与滴定109

一、基本概念109

第一节 VSV的增殖与滴定109

四、注意事项109

二、VSV的扩增与保贮110

三、VSV效价滴定110

四、注意事项111

第二节 新城鸡瘟病毒的扩增与滴定111

一、基本概念111

二、传代增殖法111

三、血凝试验法112

四、注意事项112

第四篇 病毒的免疫荧光技术113

第十五章 试剂的配制113

第一节 有关缓冲液的配制113

一、磷酸盐缓冲液(PBS)113

二、0.5M碳酸盐缓冲液(PH9.0～9.5)114

三、0.05M甘氨酸-HCI缓冲液114

四、醋酸盐缓冲液(0.2M)114

三、肝粉制备115

二、0.02%伊文思蓝液的配制115

一、纳氏试剂115

第二节 饱和硫酸铵溶液的配制115

五、Tris-HCI缓冲液(0.05M)115

第三节 其他试剂的配制115

四、福氏(Freund)佐剂的制备116

五、聚乙烯醇-甘油胶的制备(异硫氰酸荧光素染色封片用)116

六、聚苯乙烯胶(PX胶)的制备(罗丹明荧光素染色封片用)116

第十六章 免疫血清的制备117

第一节 病毒抗血清的制备方法(以乙脑为例)117

一、抗原制备117

二、免疫方法117

第二节 间接法免疫血清的制备117

一、球蛋白的提取117

二、免疫过程118

第十七章 免疫血清球蛋白的提取及纯化方法119

第一节 硫酸铵盐析法119

一、用Sophadex G50或G25柱去除法120

二、透析法120

第二节 凝胶过滤法及铵离子的去除120

第三节 DEAE-纤维素层析纯化法121

一、DEAE-纤维素层析法的原理121

二、DEAE-纤维素柱的制备122

三、加样与洗脱122

四、洗脱物的浓缩方法122

五、DEAE-纤维素的再生122

一、试剂配制123

第一节 缩脲法123

第十八章 蛋白质含量的测定123

二、测定步骤124

第二节 Folin-酚试剂法124

一、原理124

二、试剂配制124

三、测定方法124

四、标准曲线的绘制125

第三节 紫外光吸收法126

二、电泳127

一、制备琼脂板127

第十九章 抗体球蛋白纯度分析法127

第一节 免疫电泳(微量琼脂免疫电泳)127

三、染色128

第二节 醋醋纤维膜免疫电泳128

一、醋酸纤维膜的制备方法128

二、醋醋纤维膜电泳128

三、结果判断129

四、注意事项129

第二十章 抗体效价的测定方法129

第一节 环状沉淀试验129

一、稀释抗原法129

二、稀释抗体法130

第二节 双向琼脂扩散130

一、原理130

二、实验方法130

三、结果观察与分析130

三、逆向免疫扩散法及标准曲线的制备131

二、免疫吸附柱纯化羊抗兔IgG131

四、未知标本免疫活性抗体蛋白量的测定131

第三节 逆向扩散及抗体定量131

一、正常兔IgG(纯品)的提取131

第二十一章 胃酶水解抗体IgG提取F(ab )2法132

第一节 材料与方法132

一、材料132

二、方法132

第二节 注意事项133

一、蛋白浓度的测定133

二、F(ab )2的产率133

三、IgG与胃酶的比例133

四、F(ab )2的产率及纯度133

第二十二章 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(连续系统)测定蛋白质分子量133

第一节 基本原理133

第二节 器材与试剂133

二、液体配制134

一、参考蛋白134

第三节 参考蛋白与液体配制134

一、器材134

二、试剂134

第四节 样品处理及配胶加样135

一、样品处理135

二、配胶135

三、加样135

第五节 电泳及其它135

一、电泳135

二、剥胶与固定136

三、染色136

四、蛋白迁移率测定136

五、层析扫描纯度分析136

第一节 荧光素137

一、异硫氰酸荧光黄(FITC)137

二、罗达明丽丝胺(RB200)137

第二十三章 荧光抗体的制备及纯化137

第二节 抗体与荧光素的标记138

四、异硫氰酸四乙基罗达明(RBITC)138

一、概述138

三、异硫氰酸四甲基罗达明(TMRITC)138

三、异硫氰酸四乙基罗达明(RBITC)的标记方法139

四、罗达明丽丝胺标记方法139

二、FITC的标记方法139

一、分步洗脱140

第三节 荧光抗体的纯化140

二、梯度洗脱140

五、异硫氰酸四甲基罗达明标记方法140

四、计算F/P值的方法141

三、荧光素含量测定(F值测定)141

第五节 荧光素标准曲线的绘制141

一、异硫氰酸荧光黄定量测定标准曲线的绘制141

二、蛋白质测定(P)141

一、影响标记抗体特征的主要因素141

第四节 荧光抗体的鉴定141

二、罗达明荧光素定量测定标准曲线的绘制142

第六节 荧光抗体染色效价的测定与保贮143

一、特异性测定143

三、棋盘滴定144

四、荧光抗体的保贮144

二、工作稀释度测定144

第二节 鼠脑标本的制备145

二、多点细胞滴片标本的制备145

一、冷冻切片145

二、石腊切片145

一、单层细胞小玻片标本的制备145

第一节 组织培养标本的制备145

第二十四章 荧光抗体染色标本的制作145

三、鼠脑及尸检材料印片146

第三节 标本的固定146

一、直接染色法147

第一节 荧光抗体染色法147

二、间接染色法147

第二十五章 荧光抗体的染色法及观察147

第四节 标本的保存147

一、镜检149

第二节 镜检及结果判定149

二、结果判断149

四、封片149

三、双标记染色法149

第一节 荧光显微镜的构造150

一、光学系统150

第二十六章 荧光显微镜及其使用150

二、机械系统156

三、物镜倍数调节157

二、聚光器的调整157

四、标本的移动157

五、电源开关157

一、目镜聚焦157

第二节 荧光显微镜的使用方法157

三、对保管人员的基本要求158

二、荧光显微镜的擦试要求158

四、荧光显微镜使用时的注意事项158

一、荧光显微镜暗室的要求158

第三节 荧光显微镜的保养158

第二节 应用举例159

第一节 概述159

一、流感病毒159

第二十七章 免疫荧光法在病毒诊断上的应用159

二、呼吸道合胞病毒160

三、腺病毒160

六、流行性腮腺炎病毒161

五、风疹病毒161

七、单纯疱疹病毒161

四、麻疹病毒161

九、狂犬病病毒162

十、乙型脑炎病毒162

八、天花病毒162

十三、病毒性脑炎的病毒164

十二、柯赛奇病毒164

十四、流行性出血热病毒164

十一、脊髓灰质炎病毒164

一、非特异性荧光问题165

二、非特异性荧光如何去除165

第三节 小结165

第二节 ELISA的种类167

第一节 ELISA的基本原理167

一、间接法167

二、双抗体夹心法167

第二十八章 ELISA技术的基本概念167

第五篇 酶联免疫吸附试验技术167

第二十九章 ELISA技术的方法168

第一节 固相载体168

八、均相酶免疫试验168

一、主要种类168

二、常用形式168

三、检查方法168

七、抑制性酶测定168

六、免疫酶测量试验168

五、酶抗酶法168

四、双夹心法168

三、竞争法168

四、蛋白质种类169

三、蛋白质浓度169

五、离子强度169

第三节 对抗原的要求169

二、吸附时间与温度169

一、溶液的PH169

第二节 包被与洗涤169

二、稀释液170

三、稀释度170

一、标本类型170

第六节 酶的选择170

一、选择条件概述170

二、HRP的特点170

第五节 标本处理170

第四节 对抗体的要求170

二、免疫活性要好170

一、抗原纯度要高170

第七节 交联方法171

一、戊二醛交联法171

二、过碘酸钠交联法173

第九节 底物的选择174

一、底物的种类174

三、注意事项174

二、底物的选择174

三、注意事项174

二、滴定方法174

一、重要性174

第八节 结合物的浓度选择174

第十节 ELISA在人类病毒学中的应用175

一、检测病毒抗原和抗体的ELISA方法175

四、终点的选择175

二、ELISA结果判读177

三、ELISA的注意事项178

第三十章 酶联A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA、ELISA)及其在病毒学中的应用178

第一节 金葡菌蛋白A(SPA)的性质178

一、SPA的理化性质179

二、SPA的生物学性质179

第二节 PPA-ELISA在病毒学中的应用179

一、PPA-ELISA检测病毒抗体(以检测抗-HBs为例)179

二、PPA-ELISA法检测组织培养内病毒抗原180

第六篇 固相放射免疫测定在病毒学中的应用181

第三十一章 病毒抗原的固相放射免疫测定法181

第一节 试剂概述181

一、固相181

二、材料181

一、直接固相放射免疫法(直接-SPRIA)183

第二节 测定方法183

三、检测标本183

二、间接固相放射免疫法(间接-SPRIA)184

三、竞争抑制放射免疫法(竞争抑制-SPRIA)185

四、结果的表达185

五、证实试验185

六、对照185

第三十二章 病毒抗体的固相放射免疫测定法185

三、同位素标记抗体186

二、抗人免疫球蛋白和抗种免疫球蛋白186

一、病毒抗原186

第一节 试剂概述186

四、试验标本187

第二节 测定方法187

一、间接固相放射免疫法(间接-SPRIA)187

二、竞争抑制固相放射免疫法(竞争抑制SPRIA)188

三、反向放射免疫测定(反向-PSRJA)188

四、结果的表达189

第二节 测定方法的选择190

第一节 病毒测定系统的地位190

第七篇 干扰素测定方法190

第三十三章 干扰素检测要领190

一、测定方法的分类191

二、标准参考制剂191

三、病毒-细胞系统的选择192

第三节 影响测定的主要因素192

第三十四章 干扰素效价测定法193

第一节 全量细胞病变抑制测定法193

一、材料准备193

二、操作方法193

三、结果的观察、判定和意义194

第二节 微量细胞病变抑制测定法196

一、微量常规检测法196

二、微量快速检测法197

一、直接插入计算法198

二、Reed-Muench计算法198

第三节 干扰素单位计算方法198

三、回归计算法200

第八篇 干扰素单克隆抗体技术202

第三十五章 单克隆抗体技术的基础知识202

第一节 基本概念与研究简史202

一、基本概念202

第二节 两种亲本细胞的来源与主要特性203

一、浆细胞瘤株的来源与主要特性203

二、研究简史203

二、免疫鼠脾B细胞的来源与主要特性204

第三节 融合杂交细胞的选择原则与原理204

一、为什么要选择204

二、怎样选择204

三、选择原理204

第三十六章 单克隆抗体的基本方法与技术207

第一节 单克隆抗体的制备全程207

七、氨基喋呤(A)母液(×100)配法208

八、RPMI-1640完全培基的配法208

九、HAT培基的配法208

六、HT母液(×100)配法208

十、HT培基的配法208

十一、无血清BPMI-1640的配法208

十二、50%聚乙烯二醇(PEG)液的配法(W/V)208

二、200mML-谷酰胺的配法208

四、两性霉素B(25ng/ml)的配法208

三、抗生素的配法(10，000单位/ml)208

一、RPMI-1640培基的配法208

第二节 有关培基与试剂配制法208

五、5%NaHCO3的配法208

十八、庆大霉素的配制209

二十三、CO2孵箱观察碟中的溶液配制209

二十二、PBS的配制(PH7.2)209

二十一、Na-ritrate-PBS的配制(0.15MpH7.2)209

二十、8-氮嘌鸟呤的配制209

十九、1N NaOH的配制209

二十四、7.5%NaHCO2的配制209

十七、1N HC1的配制209

十六、福氏佐剂的配法209

十五、丙酮酸钠的配法209

十四、10%二甲基亚砜细胞保存液的配法209

十三、0.15MpH7.2枸橼酸钠-PBS的配法209

一、基本概念210

二、小鼠骨髓瘤细胞系的培养法210

第三节 小鼠骨髓瘤细胞系的培养法及液氮保贮与复苏法210

三、小鼠骨髓瘤细胞液氮保贮及复苏和培养法211

二、材料准备212

一、基本概念212

三、操作方法212

第四节 饲养细胞的制备方法(以小鼠腹腔巨噬细胞为例)212

二、材料准备213

一、基本概念213

三、操作方法213

第五节 免疫小鼠脾细胞的制备方法213

四、注意事项213

第六节 小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的融合方法214

一、基本概念214

四、注意事项214

二、材料准备216

三、操作方法216

四、注意事项217

第七节 融合细胞杂交瘤克隆化方法217

一、基本概念217

二、材料准备(以“有限稀释法”为例)218

三、操作方法218

四、注意事项218

第八节 单克隆抗体的制备与纯化219

一、单克隆抗体的大量制备219

二、单克隆抗体的纯化219

第九节 杂交瘤细胞及其抗体的贮存221

一、杂交瘤细胞的保存221

二、杂交瘤抗体的贮存221

第三十七章 人干扰素单克隆抗体的制备方法222

第一节 基本概念222

第二节 Namalva干扰素单克隆抗体制备方法223

一、材料与方法223

二、实验结果224

三、讨论与结论226

四、摘要226

第三节 人白细胞干扰素单克隆抗体制备方法227

一、SDS-PAC纯化法227

二、免疫BALB/C小鼠的方法229

三、融合杂交程序230

第三十八章 干扰素单克隆抗体的检测系统与方法231

第一节 检测系统231

一、检测系统的组成231

二、检测系统的原理与应用232

一、直接中和检测法235

二、间接中和检测法235

第二节 检测方法235

三、SABA检测法236

四、ELISA检测法236

第二节 水解乳蛋白培基原理及配制方法978