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第一篇病毒学基础知识1

第一章病毒的形态与结构及电镜鉴定原则1

第一节病毒的大小与形态1

一、病毒大小的概念1

二、病毒的形态特征2

第二节病毒的结构与功能2

一、病毒的基本结构与功能3

二、病毒的特殊结构与功能3

第三节病毒结构的对称性5

一、立体对称型病毒5

二、螺旋对称型病毒6

三、复合对称型病毒6

第四节病毒的电镜鉴定原则6

【附1】病毒电镜鉴定标准7

第二章病毒的生活规律及对其利用与控制25

第一节病毒的超级寄生律25

一、超级寄生的定义与原理25

二、超级寄生律的应用举例25

第二节病毒的自我复制繁殖律27

一、病毒繁殖的基本过程27

二、DNA病毒的繁殖机理29

三、单股正链小RNA病毒的繁殖机理30

四、单股负链大RNA病毒的繁殖机理31

第三节病毒的遗传与变异律32

一、病毒遗传与变异的基本特点32

二、病毒的人工定向变异33

第三章病毒的致病与免疫原理35

第一节病毒的致病特点35

一、引起细胞破坏与死亡35

二、致使细胞呈持续感染状态36

三、导致细胞转化与癌变37

第二节病毒的免疫特点37

一、机体抗病毒的胞外免疫力37

二、抗体抗病毒的胞内免疫力39

三、两种免疫的强度与持久性39

第三节干扰素的基本概念40

一、干扰素的定义与种类40

二、干扰素的基本特性40

三、干扰素诱生剂简介41

四、干扰素的产生机理42

五、干扰素的抗病毒机理43

第二篇病毒的血清学诊断方法45

第四章补体结合试验方法45

第一节鼠脑内繁殖病毒法45

一、干燥毒株鼠脑内传代繁殖法45

二、低温保存感染鼠脑悬液的制备及鼠脑内传代繁殖法47

第二节感染小白鼠的饲养观察及取脑方法47

一、感染小白鼠的饲养管理47

二、感染小白鼠的观察47

三、感染鼠脑剖取法48

第三节抗原制备方法48

一、丙酮—乙醚浸提法48

二、蔗糖—丙酮浸提法51

第四节免疫血清与待检血清制备法52

一、免疫血清制备法52

二、待检血清制备法53

第五节羊血球及溶血素的制备与滴定法53

一、羊血球制备法53

二、溶血素制备法55

三、溶血素滴定法55

四、溶血素单位的判定与保贮57

五、溶血素应用液的配制法58

第六节补体的制备与滴定法58

一、补体制备法58

二、补体滴定法59

第七节抗原滴定法61

一、方阵滴定法61

二、“直线”滴定法64

第八节补体结合试验64

一、补体结合试验程序64

二、补体结合试验方法65

第五章血凝与血凝抑制试验70

第一节试验前的各项准备工作70

一、抗原浸提与稀释用液的配制70

二、红血球保存液的配制71

三、不同pH血球稀释液的配制71

四、白陶土处理法72

五、血清处理法73

六、血凝素抗原制备法73

七、鹅血球悬液的制备法74

第二节试验方法与技术75

一、血凝及血凝抑制试验程序75

二、血凝及血凝抑制试验的操作方法与技术76

第三节血凝与血凝抑制试验方面的几个主要问题84

一、各种病毒的血凝特点84

二、几种虫媒病毒的血凝特点84

三、乙脑病毒血凝与血凝抑制特点85

第六章中和试验90

第一节试验前病毒LD50测定90

一、病毒悬液制备及稀释法90

二、小白鼠接种及观察法91

三、半数致死量（LD50）计算法92

第二节流乙脑炎病毒小白鼠中和试验94

一、流乙脑炎病毒小白鼠中和试验程序94

二、流乙脑炎病毒小白鼠中和试验法95

三、小白鼠脑内感染法96

四、观察结果及计算方法96

第三节应注意的几个问题98

一、主要影响因素98

二、组织培养中和试验98

第三篇病毒的细胞培养法100

第七章细胞培养器材处理法100

第一节玻璃器材处理法100

一、处理方法100

二、注意事项101

第二节橡皮塞及解剖器械处理法102

一、橡皮塞处理法102

二、解剖器械处理法102

第八章平衡盐溶液的基本知识及配制方法103

第一节平衡盐溶液的基本知识103

一、平衡盐溶液的种类与作用103

二、实际用途及配制要求103

第二节常用平衡盐溶液的配法104

一、Hanks′平衡盐溶液配制法104

二、Earle′s平衡盐溶液配制法104

第九章细胞培养常用试液配制法107

第一节0.5％酚红配制法107

一、大量配制法107

二、小量配制法107

第二节 7.5％ NaHCO3配制法108

第三节 0.2％中性红配制法108

第四节抗菌素配制法108

一、青链双抗配制法108

二、卡那霉素配制法109

三、二性霉素乙配制法109

第五节 1％胰蛋白酶配制法109

第六节 0.02％乙二胺四乙酸二钠溶液配制法109

第七节血清的作用及选择与注意事项110

一、血清的作用110

二、血清的选择110

三、注意事项110

第十章常用培基原理及其配制法111

第一节Eagle′s培基的基本原理及配制法111

一、基本原理与原则111

二、储存液配制方法111

三、储存液分装与保存法113

四、应用液稀释法113

第二节水解乳蛋白培基原理及配制方法113

一、基本原理113

二、配制方法114

第三节RPMI 1640培基配制114

一、来源114

二、配法114

第十一章单层细胞培养法115

第一节 鸡胚纤维母细胞培养法115

第二节 地鼠肾细胞培养法116

第三节 原代人胚肌皮细胞培养法116

第四节 猪肾细胞传代培养法118

第五节培养细胞的传代及液氮保贮与复苏法118

一、传代118

二、液氮保贮118

三、复苏119

第十二章病毒的细胞试验法120

第一节 病毒的空斑形成试验法120

第二节病毒的空斑抑制试验法121

一、固定病毒稀释血清法122

二、固定血清稀释病毒法122

第三节细胞致病作用观察法123

一、细胞病变作用的类型123

二、细胞病变程度表示法123

三、观察细胞病变的方法及注意事项123

第十三章NDV及VSV的增殖与滴定125

第一节NDV的增殖与滴定125

一、传代增殖法125

二、血凝试验法125

第二节VSV的增殖与滴定126

一、VSV的增殖126

二、VSV效价滴定（TCID50全量法）126

三、VSV效价滴定（TCID50微量法）126

第四篇病毒的免疫荧光技术127

第十四章试剂127

第一节有关缓冲液的配制127

一、磷酸盐缓冲液（PBS）127

二、0.5M碳酸盐缓冲液（PH9.0～9.5）128

三、0.05M甘氨酸—HCl缓冲液129

四、醋酸盐缓冲液（0.2M）129

五、硼酸缓冲液（0.2M硼酸盐）129

六、Tris－HC1缓冲液（0.05M）130

第二节 饱和硫酸铵溶液的配制130

第三节其他试剂的配制130

一、纳氏试剂130

二、0.02％伊文思蓝液的配制131

三、肝粉制备131

四、福氏（Freund）佐剂的制备132

五、聚乙烯醇—甘油胶的制备（异硫氰酸荧光素染色封片用）132

六、聚苯乙烯胶（pX胶）的制备（罗丹明荧光素染色封片用）132

第十五章免疫血清的制备133

第一节病毒抗血清的免疫方法（以乙脑为例）133

一、抗原制备133

二、免疫方法133

第二节间接法免疫血清的制备134

一、球蛋白的提取134

二、免疫过程135

第十六章免疫血清球蛋白的提取及纯化方法137

第一节 硫酸铵盐析法137

第二节铵离子的去除及凝胶过滤法138

一、用Sephadex G50或G25柱去除法138

二、透析法139

第三节DEAE—纤维素层析纯化法140

一、DEAE—纤维素层析法的原理与选择原则140

二、DEAE—纤维素柱的制备140

三、加样与洗脱141

四、洗脱物的浓缩方法141

五、DEAF—纤维素的再生141

第十七章蛋白质含量的测定143

第一节缩脲法143

一、试剂配制143

二、测定步骤143

第二节Folin—酚试剂法143

一、原理143

二、试剂配制144

三、测定方法144

四、标准曲线的绘制145

第三节 紫外光吸收法147

第十八章抗体蛋白质纯度的分析法149

第一节免疫电泳（微量琼脂免疫电泳）149

一、制备离子琼脂板149

二、电泳149

三、染色150

第二节醋酸纤维膜免疫电泳150

一、醋酸纤维膜的制备方法150

二、醋酸纤维膜电泳151

三、结果判断151

第十九章抗体效价的测定方法151

第一节环状沉淀试验152

一、稀释抗原法（例如测定全免疫血清）152

二、稀释抗体法（如测定抗IgG血清）152

第二节双向琼脂扩散153

一、原理153

二、实验方法153

三、结果观察与分析154

四、染色154

第三节逆向扩散抗体（Ab）定量154

一、正常兔IgG（纯品）的提取154

二、免疫吸附柱纯化羊抗兔IgG155

三、逆向免疫扩散法及标准曲线的制备155

四、未知标本免疫活性抗体蛋白量的测定155

第二十章胃酶水解免疫球蛋白G提取F（ab）2法157

第一节材料与方法157

一、材料157

二、方法157

第二节注意事项158

一、蛋白浓度的测定158

二、F（ab′）2的产率158

三、IgG与胃酶的比例158

四、F（ab′）2的产率纯度158

第二十一章SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量（连续系统）159

第一节 基本原理159

第二节器材与试剂159

一、器材159

二、试剂159

第三节参考蛋白与液体配制160

一、参考蛋白160

二、液体配制160

第四节样品处理及配胶加样161

一、样品处理161

二、配胶162

三、加样162

第五节电泳及其它162

一、电泳162

二、剥胶与固定162

三、染色163

四、蛋白迁移率测定163

五、层析扫描纯度分析163

第二十二章荧光抗体的制备及纯化165

第一节荧光素165

一、异硫氰酸荧光黄（Fluorescein isothio cyanate－FIT C）165

二、罗达明丽丝胺（RB200）（Tetraethyl Rhodamine Compounds）166

三、异硫氰酸四甲基罗达明（TMRITC）166

四、异硫氰酸四乙基罗达明（RBITC）167

第二节抗体荧光素的标记167

一、概述167

二、FITC的标记方法168

三、异硫氰酸四乙罗达明（RBITC）标记方法169

四、四乙基罗达明（Tetrasthyl Rhodeamine）（B－200）标记方法170

五、异硫氰酸四甲基罗达明（Tecromethyl Rhodamine isothiocyanate TMRITC）记标方法171

第三节荧光抗体的纯化171

一、分步洗脱171

二、梯度洗脱172

第四节荧光抗体的鉴定172

一、标记抗体的鉴定标准172

二、蛋白质测定（P）172

三、荧光素含量测定（F值测定）172

四、计算平均F/P值的方法172

第五节荧光素标准曲线的绘制173

一、异硫氰酸荧光黄定量测定标准曲线的绘制173

二、罗丹明荧光素定量测定标准曲线的绘制174

第六节荧光抗体染色效价的测定与保贮176

一、特异性测定176

二、工作稀释度测定176

三、棋盘滴定177

四、荧光抗体的保贮177

第二十三章荧光抗体染色标本的制作178

第一节组织培养标本的制备178

一、单层细胞小玻片标本的制备178

二、多点细胞滴片标本的制备178

第二节鼠脑标本的制备179

一、冷冻切片179

二、石腊切片179

三、鼠脑及尸检材料印片179

第三节 标本的固定179

第四节 标本的保存180

第二十四章荧光抗体的染色法及观察181

第一节荧光抗体染色法181

一、直接染色法181

二、间接染色法182

三、双标记染色法183

四、封片183

第二节镜检及结果判定183

一、镜检183

二、结果判断184

第二十五章荧光显微镜及其使用185

第一节荧光显微镜的构造185

一、光学系统185

二、机械系统192

第二节荧光显微镜的使用方法193

一、目镜聚焦193

二、聚光器的调整193

三、物镜倍数调节193

四、标本的移动194

五、电源开关194

第三节荧光显微镜的保养194

一、荧光显微镜暗室的要求194

二、荧光显微镜的擦拭要求195

三、对保管人员的基本要求195

四、荧光显微镜使用时的注意事项195

第二十六章免疫荧光法在病毒诊断上的应用197

第一节 概述197

第二节应用举例197

一、流感病毒（Influenza virus）197

二、呼吸道合胞病毒（RSV）198

三、腺病毒（Adenovirus）198

四、麻疹病毒（Measles Virus）199

五、风疹病毒（Rbella Virus）199

六、流行性腮腺炎病毒（Mumps Virus）200

七、单纯疱疹病毒（Herpes Group Viruses）200

八、天花病毒（Pox Virus）200

九、狂犬病病毒（Rabies Virus）200

十、乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus）201

十一、脊髓灰白质炎病毒（Polio Virus）203

十二、柯赛奇病毒（Coxsackic Virus）203

十三、病毒性脑炎203

十四、流行性出血热病毒203

第三节小结204

一、非特异性荧光问题204

二、非特异如何去除204

第五篇病毒酶联免疫吸附试验技术208

第二十七章ELISA试验的原理208

第一节 基本原理208

第二节目前常用的几种ELISA技术的原理208

一、竞争性试验208

二、非竞争性试验（夹心法）209

三、ELISA法应用于组织抗原定位209

四、均一酶标记免疫试验209

第二十八章病毒酶联免疫吸附试验方法211

第一节试剂与设备211

一、固相载体211

二、缓冲液211

三、酶和酶结合物的制备212

第二节ELISA在人类病毒学中的应用214

一、检测病毒抗原和抗体的ELISA方法215

二、ELISA结果判读217

三、ELISA的注意事项218

第二十九章酶联A蛋白的酶联免疫吸附试验（PPA－ELISA）及其在病毒学中的应用220

第一节金葡菌蛋白A（SPA）的性质220

一、SPA的理化性质220

二、SPA的生物学性质220

第二节PPA－ELISA及其在病毒学中的应用221

一、PPA－ELISA检测病毒抗体（以检测抗－HBs为例）221

二、PPA－ELISA法检测组织培养内病毒抗原222

第六篇固相放射免疫测定在病毒学中的应用223

第三十章病毒抗原的固相放射免疫测定法223

第一节试剂概述223

一、固相223

二、材料223

第二节测定方法226

一、直接固相放射免疫法（直接—SPRIA）226

二、间接固相放射免疫法（间接—SPRIA）227

三、竞争抑制放射免疫法（竞争抑制—SPRIA）228

四、结果的表达228

五、证实试验229

六、对照229

第三十一章病毒抗体的固相放射免疫测定法230

第一节试剂概述230

一、病毒抗原230

二、抗人免疫球蛋白和抗种免疫球蛋白230

三、同位素标记抗体231

四、试验标本231

第二节测定方法231

一、间接固相放射免疫法（间接—SPRIA）231

二、竞争抑制固相放射免疫（竞争抑制SPRIA）232

三、反相放射免疫测定（反相—SPRIA）233

第七篇干扰素测定方法237

第三十二章干扰素检测要领237

第一节 病毒测定系统的地位237

第二节测定方法的选择238

一、测定方法的分类238

二、标准参考制剂238

三、病毒—细胞系统的选择239

第三节 影响测定的主要因素239

第三十三章干扰素效价测定方法241

第一节全量细胞病变抑制测定法241

一、材料准备241

二、操作方法242

三、结果的观察、判定和意义243

第二节微量细胞病变抑制测定法245

一、材料准备245

二、操作方法245

第三节中性红摄入测定法246

一、基本原理与优点246

二、操作技术246

三、主要影响因素248

四、干扰素素单位计算法248

第三十四章人干扰素改良微量测定法251

第一节材料与方法251

一、材料251

二、方法251

第二节实验结果252

一、形成良好单层的最适细胞浓度与体积252

二、以微量法和全量法测定HulFN－α（Ly）的比较252

第三节 讨论与结论253

第八篇干扰素单克隆抗体技术255

第三十五章单克隆抗体技术的基础知识255

第一节基本概念与研究简史255

一、基本概念255

二、研究简史256

第二节两种亲本细胞的来源与主要特性256

一、浆细胞瘤株的来源与主要特性257

二、免疫鼠脾B细胞的来源与主要特性257

第三节融合杂交细胞的选择原则与原理258

一、为什么要选择258

二、怎样选择258

三、选择原理258

第三十六章单克隆抗体的基本方法与技术261

第一节浆细胞瘤细胞培养物的制备261

一、材料与设备261

二、操作方法261

三、技术说明262

第二节免疫信息细胞的制备方法262

一、免疫方法262

二、免疫β－淋巴细胞的制备263

三、技术说明264

第三节溶液及培基和饲喂细胞的制备264

一、完全的DMEM培养液264

二、HAT培养基贮备液的制备264

三、聚乙二醇（PEG）溶液制备265

四、饲料细胞的制备265

五、技术说明266

第四节细胞融合266

一、细胞融合的准备工作267

二、细胞融合操作过程267

三、HAT培基的使用方法268

四、技术说明268

第五节杂交瘤细胞的选择269

一、固相放射免疫分析269

二、结合分析试验270

三、技术说明270

第六节杂交细胞的克隆化培养271

一、软琼脂法271

二、有限稀释法272

三、技术说明272

第七节单克隆抗体的制备与纯化273

一、单克隆抗体的大量制备273

二、单克隆抗体的纯化273

第八节杂交瘤细胞及其抗体的贮存275

一、杂交瘤细胞的保存275

二、杂交瘤抗体的贮存276

第三十七章Namalva干扰素单克隆抗体的制备方法276

第一节Namalva干扰素单克隆抗体杂交瘤的产生与筛选277

一、材料与方法277

二、实验结果278

三、讨论与结论281

第二节Namalva干扰素单克隆抗体的动物免疫方法282

一、动物的选择282

二、免疫抗原的制备282

三、免疫途径与方法282

四、干扰素抗体效价的定义282

第三节Namalva干扰素单克隆抗体的检测方法283

一、INAS50检测方法283

二、反向空斑检测法285