《分子选殖 遗传工程理论及实验手册》求取 ⇩

第一章媒介与宿主系统1

（壹）质体2

一　选殖DNA至质体中的方法10

（贰）λ噬菌体15

一溶裂循环18

二 潜溶作用21

三 制造λ噬菌体媒介22

四 选择适当的媒介23

五 λ媒介的遗传图24

（叁）凝聚质体44

（肆）拥有单股核酸的噬菌体50

（伍）结论51

第二章　菌株及噬菌体的繁殖与保存55

壹菌落的纯化程序57

贰 菌株的生长，维持与保存59

叁 λ噬菌体溶菌斑的纯化程序61

肆 培养基与抗生素65

第三章λ噬菌体及质体DNA的分离71

壹大量λ噬菌体的制备72

（壹）噬菌体的感染72

（贰）噬菌体的诱发73

（叁）λ噬菌体的纯化75

（肆）λ噬菌体DNA的抽取79

贰质体DNA大量分离法80

（壹）菌体的生长以及质体的繁殖81

（贰）菌体的收集与溶裂82

（叁）利用Cesium Chloride-Ethidium Bromide密度梯度衡定离心的技术纯化环状DNA85

（肆）质体DNA样品中RNA的去除86

第四章　分子选殖必需的酶类89

壹限制酶90

（壹）同座限制酶91

（贰）甲基化作用94

（叁）利用限制酶分解DNA96

贰适用于分子选殖技术的他种酶类98

（壹）大肠菌DNA聚合酶Ⅰ98

（贰）大肠菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段103

（叁）T4 DNA聚合酶107

（肆）利用T4聚核苷酸激酶标志DNA的5′末端112

（伍）转录RNA的DNA聚合酶117

（陆）DNA脱磷酸作用122

（柒）Bal 31核酸酶124

核酸酶S1128

绿豆核酸酶129

核糖核酸酶129

脱氧核糖核酸酶Ⅰ130

外核酸酶Ⅶ130

外核酸酶Ⅲ131

λ外核酸酶132

聚（A）聚合酶133

T4 DNA接合酶134

T4 RNA接合酶135

Eco RI修饰酶135

末端脱氧核糖核苷酸转移酶136

第五章　胶体电泳137

壹琼脂糖胶体电泳138

（壹）胶体电泳器140

（贰）缓冲液140

（叁）琼脂糖胶体的配制143

（肆）琼脂糖胶体中DNA的染色146

（伍）胶体的照像147

（陆）迷你胶体147

（柒）琼脂糖胶体上DNA的回收149

（捌）碱性琼脂糖胶体154

贰聚丙烯醯胺胶体电泳155

（壹）聚丙烯醯胺胶体的装备方法156

（贰）DNA自聚丙烯醯胺胶体上的回收160

叁　DNA分股用的胶体160

（壹）利用聚丙烯醯胺胶体分离DNA的两股161

（贰）利用琼脂糖胶体分离DNA的两股162

（叁）利用变性溶液与聚丙烯醯胺胶体电泳分离短小DNA的两股164

第六章　真核细胞m-RNA的抽取，纯化与分析167

（壹）分离哺乳动物细胞中的mRNA170

（贰）细胞中全部RNA的分离法172

（叁）聚腺苷酸RNA的筛选174

（肆）RNA的胶体电泳176

（伍）利用核酸酶S1图谱RNA182

第七章　反讯息DNA的合成及选殖185

壹反讯息DNA的合成186

（壹）反讯息DNA第一股的制造186

（贰）反讯息DNA第二股的制造188

（叁）利用核酸酶S1切除反讯息DNA上的发夹状圆弧189

贰双股反讯息DNA的分子选殖190

（壹）含同种聚合物的尾端190

（贰）人工制造的DNA接头192

（叁）选殖反讯息DNA的其他方法194

叁反讯息DNA选殖的策略197

（壹）量多mRNA转录为反讯息DNA197

（贰）量少mRNA转录为反讯息DNA198

肆选殖反讯息DNA的程序203

（壹）双股反讯息DNA的合成方法203

（贰）利用核酸酶S1分解反讯息双股DNA209

（叁）反讯息双股DNA的选殖212

（肆）媒介DNA与反讯息双股DNA的氮基冷却配对215

（伍）利用先后添加接头的方式选殖反讯息双股DNA215

第八章　转移质体及λ噬菌体DNA于大肠菌体内的技术219

壹转化质体DNA于大肠菌体内的程序220

（壹）使用氯化钙的转化程序221

（贰）使用氯化钙与氯化铷的转化程序222

（叁）使用大肠菌x1776菌株的转化程序223

贰在活体外装填λ噬菌体DNA的方法225

（壹）潜溶性λ噬菌体的保存与测定227

（贰）制造装填用噬菌体——程序Ⅰ229

（叁）活体外装填DNA——序Ⅰ230

（肆）制造装填用噬菌体——程序Ⅱ232

（伍）活体外装填DNA——程序Ⅱ234

第九章　建立基因组集合库237

壹利用λ噬菌体媒介建立基因组的集合库238

（壹）制造媒介DNA242

（贰）利用组织培养皿上的真核细胞分离高分子量的DNA246

（叁）制备长度为20kb的真核细胞DNA248

（肆）DNA的接合与装填252

（伍）集合库中噬菌体的增数257

贰利用凝聚质体建立基因组集合库258

（壹）利用磷酸盐酶处理的凝聚质体作为携带选殖DNA的媒介259

（贰）利用两种限制酶及磷酸盐酶处理的凝聚质体作为携带选殖DNA的媒介263

（叁）含有选殖DNA的集合库的增数，贮存，以及筛选267

第十章　含有重组DNA的纯系的鉴定271

壹菌落或溶菌斑的原位杂合273

（壹）少量菌落的杂合273

（贰）复印菌落于硝化纤维滤纸上的程序276

（叁）利用杂合作用鉴定λ噬菌体的溶菌斑278

（肆）λ噬菌体溶菌斑在原位增数后再以杂合法鉴定的程序280

（伍）固定于滤片上的DNA或RNA与辐射性探测核酸杂合的程序281

（陆）复印有噬菌体溶菌斑或者细菌菌落的滤片与探测核酸杂合的程序283

贰利用杂合筛选法鉴定含有反讯息DNA的菌落或噬菌体286

（壹）利用固定于硝化纤维滤片上的DNA从事杂合筛选286

（贰）利用杂合作用筛选的RNA在网织红血球溶裂液中转译产生蛋白质295

（叁）注射mRNA于蛙卵细胞中以转译的方式产生蛋白质299

叁利用探测DNA与特定序列的DNA在大肠菌体内重组的现象筛选集合库中携带特殊外来DNA段落的λ噬菌体302

（壹）重组筛选法的原理302

（贰）筛选πVX质体用的菌株306

（叁）πVX质体的制备306

（肆）质体进入W3110r-m+（P3）菌株的转化作用306

（伍）利用λ噬菌体集合库感染W3110r-m+（P3）（πVX）菌株307

（陆）鉴定噬菌体的阻遏基因307

（柒）测试πVX质体系统307

（捌）πVX系统的应用310

第十一章　含重组DNA纯系的分析313

壹λ噬菌体DNA或者质体DNA的快速分离314

（壹）质体DNA小规模快速的分离314

（贰）λ噬菌体DNA小规模快速的分离317

贰建立DNA上限制座分布的图形319

（壹）单一或共同分解320

（贰）依次分解321

（叁）局部分解323

叁Southern转移法326

（壹）转移琼脂糖胶体中的DNA至硝化纤维滤纸上的程序327

（贰）DNA转移至滤片上以后的杂合程序329

肆分殖小假DNA于质体媒介中的程序331

（壹）具有凝聚末端的DNA的分殖法332

（贰）利用人造接头协助DNA的分殖工作333

（叁）接合二齐尾DNA作为产生限制座的方法337

（肆）选殖步骤快速依次进行的方法339

第十二章　能够在大肠菌体内表现其所携带之选殖DNA的媒介质体341

壹促进因子342

（壹）利用λ噬菌体的PL促进因子的媒介质体343

（贰）其他的促进因子347

贰 核糖体结合座347

叁真核细胞基因的表现348

（壹）使选殖DNA产生非融合性真核细胞蛋白质的媒介348

（贰）使选殖DNA产生融合性真核细胞蛋白质的媒介355

肆 选殖基因的高度表现366

伍 增加基因的数量369

陆 摘要370

附录373

壹附录A：生化技术374

（壹）玻璃及塑胶器皿374

（贰）配制有机溶剂375

（叁）液体培养基376

（肆）含洋菜或者琼脂糖的固体培养基378

（伍）浓缩培养基378

（陆）用于λ噬菌体实验的溶液378

（柒）抗生素379

（捌）缓冲液与其他溶液的配制380

（玖）酶类385

（拾）限制酶分解程序必需的缓冲液387

（拾壹）常用的电泳缓冲液388

（拾贰）常用的装填染料389

（拾叁）透析膜袋的清洗390

（拾肆）乙醇与水混合溶液中32P-核苷酸的干燥方法390

（拾伍）核酸的纯化391

（拾陆）核酸的浓缩393

（拾柒）Sephadex G-50层析程序395

（拾捌）DNA及RNA的定量398

（拾玖）自动辐射照像术400

（贰拾）测量核酸的辐射活性402

（贰拾壹）剪接质体成长短不一的段落作为分子量比较的标志403

（贰拾贰）Maxam-Gilbert的DNA序列分析技术404

贰附录B：pBR322408

（壹）pBR322的核苷酸序列408

（贰）pBR322上的限制座417

（叁）pBR322 DNA上含有限制座的段落422

叁 附录C：常用的细菌菌株433

参考文献437

索引451