《表1 PCR引物和序列：铁皮石斛灰霉病病原分离鉴定及防治》

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《铁皮石斛灰霉病病原分离鉴定及防治》

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用真菌基因组DNA提取试剂盒提取HS1的总基因组DNA，针对致病菌DNA的内部转录间隔区（ITS），3-磷酸甘油醛脱氢酶（G3PDH），热休克蛋白60（HSP60），RNA聚合酶Ⅱ亚单位（RPB2）进行PCR扩增，具体引物序列参考表1。PCR体系为25μL，包括12.5μL的2×PCR master mix（武汉擎科生物技术有限公司），9.5μL的双蒸水，引物各1μL（25 pmol·μL-1），模板DNA 1μL（10 ng·L-1）。ITS序列扩增程度为:94℃变性5 min；94℃变性1 min；60℃退火1 min；72℃延伸1 min，35次循环；再72℃延伸7 min[6]；HSP60序列及RPB2序列扩增程度相同为:94℃变性5 min；94℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸90 s，35次循环；再72℃延伸7 min；G3PDH序列扩增程度为:94℃变性5 min；94℃变性30 s；64℃退火30 s；72℃延伸90 s，35次循环；再72℃延伸7 min[7]。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后，由武汉奥科生物技术有限公司纯化后测序。测序结果通过NCBI的BLAST程序与GenBank中核酸数据进行同源性比对。利用16S r DNA构建系统进化树时，选择Botrytis属中同源性高的B.globosa，B.cinerea，B.convoluta，B.fabae，B.gladiolorum，B.globosa，B.hyacinthi，B.tulipae等作为内群，Monilinia fructigena作为外群。序列先用Clustal X进行多重比对，再用MEGA5.0软件，邻接法（neighbor joining）聚类分析并构建系统进化树，自展值（bootstrap value）1 000次重复检验。