《表1 慢病毒转染鸡成纤维细胞转染液成分 (μL)》

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《转基因诱导永生化鸡细胞系的建立》

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CEF细胞获得后，按照每孔150 000的细胞数量接种到12孔培养板中，置入37℃、5%CO2培养箱内培养。24 h之后，用含有6种人类干细胞因子（POU5F1，NANOG，SOX2，LIN28，KLF4和C-MYC）的慢病毒载体在20 MOI下进行慢病毒转染，并加入1×TransDux（System Biosciences）助转剂，转染液配置比例（表1）。转染24 h之后，弃掉转染液，用DPBS清洗，然后将转染过的CEF细胞用加入0.05%trypsin，37℃消化3～5 min，加入培养液终止消化，并用移液器反复吹打培养皿底，使细胞绝大部分脱壁，将细胞悬液移入离心管中，DMEM培养液清洗培养皿3次，将这些细胞混合液收集到离心管，以1 000 r/min离心5 min。去除上清液，加入DPBS吹打重悬，清洗，再离心一次，去上清，用预热的干细胞培养液DMEM/F12（Gibco）中添加20%无血清培养液KSR（Gibco），2 mmol/L L-谷氨酸（Gibco），0.1 mmol/L非必需氨基酸（Gibco），50 Unit/mL青霉素，50μg/mL链霉素（Gibco），0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇（Sigma-Aldrich），10 ng/mL bFGF生长因子；（Sigma-Aldrich and R&D System）重悬细胞，接种至已经用丝裂霉素C灭活的MEF细胞饲养层上，置入37℃、5%CO2培养箱内培养。