《表1 Real-time PCR引物序列》

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《不同年龄耳廓来源软骨细胞的生物学特性研究》

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Trizol法提取细胞总RNA，利用Nanodrop2000超微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，以Oligo（d T）15为引物，d NTP Mix为原料，取1 000 ng总RNA在M-MLV逆转录酶作用下合成cDNA。构建20μl Real-time PCR反应体系进行扩增:95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃复性及延伸30 s，如此40个循环后进行60～95℃的熔解曲线分析。由LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行数据获取并分析，GAPDH作为内参基因进行标准化，应用2-△△CT法进行相对定量的计算。正、反向引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列见表1。实验设置每组至少3个生物学重复，每个基因设置3个复孔，结果取平均值，利用GraphPad Prism进行统计绘图。