《表1 柱前衍生高效液相色谱法分析氨基酸的衍生试剂及方法比较》

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《中草药中氨基酸的前处理及色谱法分析》

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所有氨基酸中，除色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有紫外吸收性质外，其余氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收，因此，进行紫外或荧光检测前大多需要衍生。目前，已经发展了多种柱前、在线或柱后衍生的方法[29]。其中，在线衍生法是在色谱柱内进行衍生反应，所需反应试剂用量相对较少，但柱内需要配备反应搅拌装置；柱后衍生法可使用多种检测器，但要求反应速率快、反应室体积小。所以，目前使用较多的是柱前衍生方法，现已发展的柱前衍生试剂主要包括邻苯二甲醛（OPA）[30]、异硫氰酸苯酯（PITC）[31]、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）[32]、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）[33]、二硝基氟苯（DNFB）[34]、1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺（FDNPAA）[35]、磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABS-Cl）[36]、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）[37]和2，4-二硝基氯苯（CDNB）[38]等。各种柱前衍生方法均有一定优缺点（表1），如OPA法不能检测胱氨酸及亚氨基酸，且衍生产物稳定性差，其最大优点是无过量衍生试剂及副产物干扰；FMOC法可检测亚氨基酸，且衍生产物稳定，荧光和紫外均可检测，缺点是不能检测胱氨酸，副产物难以去除，对测定有干扰；Dansyl-Cl法既可检测亚氨基酸，又能检测胱氨酸，衍生物稳定性好，优点是无副产物干扰，缺点是紫外检测灵敏度较低；PITC法可检测亚氨基酸和胱氨酸，衍生产物稳定，20℃可保存30 d，可采用真空干燥法去除多余衍生试剂，效果良好，但即使极微量的衍生试剂也可污染色谱柱而影响柱效。2006年6月，在天津市召开的药品中氨基酸的测定方法研讨会推荐首选测定方法为PITC柱前衍生法。采用紫外检测时基线平稳，衍生物的稳定性较好，且衍生反应时间对衍生效率影响不大，灵敏度可达100 pmol。当采用荧光检测时，灵敏度可达pg (fmol）水平，几乎提高3个数量级，但对流动相的纯度要求较高，梯度洗脱会引起基线漂移；对检测条件要求苛刻，氨基酸含量较低的样品适宜采用荧光检测法检测。另外，液相色谱法分离测定氨基酸时常用氨基酸分析专用方法包，诸如Waters公司开发的AccQ-Tag试剂包法和Pico-Tag试剂包法，配合优化的溶剂洗脱条件及专用分析柱，使氨基酸在20 min内得到高效分离，灵敏度可达0.5～1.0 pmol级，一、二级氨基酸都能测定，衍生操作简单，分析时间短。但是，因衍生试剂方法包价格较高而限制了其广泛应用。氨基酸的分离亦可采用普通的反相色谱法，如采用C18，C8柱或BEH Amide亲水色谱柱[39]。