《表3 BPA诱导下双齿围沙蚕候选内参基因表达稳定性排名》

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《双酚A诱导下双齿围沙蚕实时荧光定量PCR内参基因的筛选》

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随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）凭借其较好的精确性和灵敏性在研究基因表达方面得到广泛的应用。在进行qRT-PCR的时候，为了获得更为可靠的结果，不仅要控制实验设计和操作过程中的误差，更要选择合适的内参基因[23]。理想条件下的内参基因需要有以下特点:1) 在同一物种的不同发育阶段和不同的组织器官中的表达量不存在显著差异[24]；2) 不受内源或者外源性因素的影响，在诱导条件下表达稳定；3) 所选取的内参基因与目的基因的表达水平相近；4) 选择的内参基因不存在假基因（pseudo gene），从而避免基因组DNA的扩增[25]。但是在实际实验过程中，符合以上所有条件的内参基因基本不存在，在选取内参基因的时候仅根据文献来筛选是远远不够，还应该在特定的测试条件下仔细分析和评估选定内参基因的稳定性。目前常用的内参基因包括Actin、Tub、EF1α、GADPH以及HH2A等，其中Actin是最为常用的内参基因。曹滕飞等[26]在对氨态氮诱导下的成体菲律宾蛤仔鳃组织中内参基因的研究时发现，在18S rRNA、Actin、Tub、EF1α、Ub和CyPA 6个候选内参基因中，表达最稳定基因是EF1α，Actin的表达也比较稳定，没有出现较大的差异，说明在同一组织器官中，Actin在诱导前后的表达量差异不大。张丽莉等[15]的研究显示，杂色鲍在变态过程及幼虫甲状腺激素受体（TR）干扰下，Actin的表达量均有较高和稳定的水平，因此Actin可以作为研究杂色鲍发育和甲状腺激素受体干扰时的内参基因。徐建波等[27]亦对杂色鲍的变态过程中3个阶段的幼虫进行内参基因的分析，发现Actin的表达十分稳定，在RNAi条件下，Actin的稳定性仅次于RPS9，更进一步的验证了Actin在杂色鲍变态过程中可以当作内参基因使用。除此之外，Zheng等[28]在对牙鲆（Paralichthys olivaceu）的内参基因研究也证明了Actin作为通用内参基因的稳定性很高。本实验室之前的研究发现，无论在铜、镉等无机重金属，还是在石油烃和溴氰菊酯等有机污染物的胁迫下，双齿围沙蚕Actin的表达都相对稳定[18-19]。在本实验结果，Bestkeeper和Normfinder软件分析发现，Actin是最稳定的内参基因，而在Ge Norm软件中获得的最稳定的内参基因是SDHA，Actin仅排在第3位。虽然不同软件算法存在少许差异，从表3可以看到Actin的稳定性排名在3种软件的分析结果中均为位于前三，说明Actin不论是在表达丰度上还是表达的稳定性上都是最好的。虽然SDHA的稳定性排名也较高，但是其在双齿围沙蚕体内的表达量没有Actin高，因此推荐Actin作为双齿围沙蚕的通用内参基因。