《表2 壳聚糖酶基因异源表达水平》

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《枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性》

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注:-.无数据。下同。

密码子偏好、基因拷贝数和高密度发酵等是影响外源基因在毕赤酵母中表达的重要因素[27]。提高偏好密码子的使用频率及密码子适应指数是提高外源蛋白表达量的有效方法之一[27-28]。本研究通过密码子优化使得目的基因的密码子适应指数显著提高，具有在巴斯德毕赤酵母中高效表达的潜力。在一定范围内，增加基因拷贝数能够提高蛋白表达量[27]。研究通过G418抗性为筛选标记，从G418质量浓度为3 mg/mL的平板上筛选了1株高壳聚糖酶活性的转化子，相当于12个基因拷贝数，一定程度提高了蛋白表达量。甲醇流加策略是影响菌体密度和外源蛋白表达量的关键因素之一，适宜的甲醇流加速率是细胞形成高密度的关键[29]。根据溶氧反馈机制，采用甲醇四阶段流加策略，根据不同生长阶段溶氧变化调整甲醇流加速率，维持溶氧大于20%，避免了发酵过程中溶氧不足和甲醇累积，从而使菌体密度显著提升。在以上多种因素的共同影响下，目的蛋白的表达水平显著提高。与文献报道的壳聚糖酶基因克隆表达水平相比，该酶的表达水平远高于现有文献的重组壳聚糖酶高密度发酵水平（表2），具有很好的工业应用前景。