《表1 胶回收蛋白与在含POPC和胆固醇1∶1 mol%的磷脂双分子层膜上成孔蛋白中环形孔与弧形孔的比例的比较》

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《优化的Native PAGE蛋白回收方法在AFM中的应用》

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为了验证回收蛋白的效果，本研究采用AFM对回收后的蛋白进行成像（图3），可以看出回收出的蛋白种类一致，为单一的环形PFO寡聚体，虽然有一些小分子杂质，不会影响AFM扫描或对探针造成伤害、污染，从高度上看，除了环形复合物之外，基本没有降解导致断裂的寡聚体，最主要的是，通过回收凝胶上单一条带上的蛋白，所得的蛋白产物均为大小一致的环形复合物，而没有其他条带上的蛋白掺杂，充分说明了该方法回收蛋白的纯度是非常高的。环形复合物的直径大小（从直径上一端边缘厚度的中点到另一端边缘厚度的中点的距离）为（30±4）nm，n=31，且中心孔径为（15±2）nm，n=31，均和实际大小吻合。统计显示，经过切胶回收单一条带而纯化出的蛋白基本都是环形复合物。在磷脂双分子层膜上成孔蛋白中环形孔与弧形孔的比例是比较低的，只有1/3是环形复合物，经过该方法处理之后，显著提高了这一比例，达到了为提高AFM分辨率所需的单一蛋白种类的要求（表1）。实验结果显示，回收的蛋白成像时只需将蛋白滴在云母上，而不需要磷脂膜的支持，所以成像较容易获得干净的样品而不会因为磷脂膜制备不均匀导致蛋白结合在膜上时不均匀地聚集；缩小扫描范围后若要得到更高的分辨率，对于含有不同亚基数的异质样品则十分具有挑战性（图1C），需要花费很多时间和探针，相比之下，经过该方法纯化回收的蛋白能够轻松地在比之前的异质样品小约4倍的范围内成像（图4），并获得了更高的分辨率。