《表1 研究中所采用的引物探针序列》

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《一种检测kras基因突变的新型TB-ARMS qPCR方法的建立》

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本研究针对kras基因12和13号外显子上8种常见突变类型，包括c.34G>A（p.G12S）、c.34G>T（p.G12C）、c.34G>C（p.G12R）、c.35G>T（p.G12V）、c.35G>A（p.G12D）、c.35G>C（p.G12A）、c.37G>T（p.G13C）和c.38G>A（p.G13D）的点突变，采用Oligo 7软件辅助设计ARMS-PCR等位基因特异性引物，并控制其Tm值，以便筛选出与富集扩增反应条件相适应的最佳引物。采用的富集扩增反应条件较高退火温度为64℃，设计突变特异性引物时控制引物的Tm值范围为50-60℃。封闭引物序列与野生型等位基因位点完全匹配，包括引入修饰的碱基，封闭引物Tm值要大于等于退火温度，确保其在退火时与野生型模板结合起封闭作用，并且封闭引物3′末端经修饰，使其在DNA聚合酶作用下不能被延伸。同时设计锁核酸修饰封闭引物，可使引物Tm值增加5-10℃，修饰碱基为kras突变等位基因对应的野生型基因，以增强封闭引物对野生型等位基因的区分能力。封闭引物3′末端碱基采用磷酸化修饰。由于8种点突变位点在外显子上的位置靠近，因此可采用相同的封闭引物。同时采用beta-actin基因作为内参照基因，对其设计常规引物探针，用以对反应的质量进行监控。所有引物、探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本研究所采用的引物探针序列见表1。