《表3 重组兽疫链球菌株的透明质酸分子量分析》

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《发酵透明质酸寡糖兽疫链球菌工程菌株的构建》

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将兽疫链球菌重组菌株SZpnz、SZha、SZh6、SZhah6、SZh6ha与野生菌株WT进行摇瓶发酵，第24小时的HA产量结果如图5所示，带有空载体pNZ8148的重组菌SZpnz的HA产量略微高于野生菌。其原因是外源质粒带来的应激效应有利于HA产量提高，但不显著[34]。相对于野生菌株，重组菌SZha、SZh6的HA产量明显提高，分别提高了72.0%和83.4%。has A的过表达，导致更多透明质酸合酶竞争前体UDP-Glc UA和UDP-GlcNAcHA，使HA分子量显著降低，进而导致HA产量的显著增加[34]。摇瓶发酵过程中，随着发酵液粘稠度上升导致溶氧降低，严重影响细胞的正常代谢和HA产量的提高[30]，而LHAase的分泌表达使得重组菌在产HA的同时也能对HA进行降解，有效缓解发酵过程的溶氧问题，有益于HA产量提高。相比于野生菌，重组菌SZhah6、SZh6ha的HA产量分别提高了94.8%和182.0%。由于摇瓶发酵不能对pH值、溶氧、碳源浓度等发酵条件进行有效控制，导致菌体密度低，HA产量低。因此，根据摇瓶发酵的结果，以野生菌株作为对照，将重组菌SZh6ha在3 L发酵罐中进行放大发酵，结果如图6所示。重组菌SZh6ha培养12 h就开始进入稳定期，野生菌培养16 h才进入稳定期，重组菌的菌体浓度一直低于野生菌，这可能与重组菌表达LHAase和过表达Has A对细胞生长造成压力有关。发酵培养前8 h，HA积累量少，生长对数期的中后期，HA开始快速积累，细菌生长的稳定期HA依然在积累。发酵24 h时重组菌SZh6ha的HA积累量约为7.06 g/L，是摇瓶发酵水平的7.25倍，相比于野生菌的3 L发酵罐水平提高了112.4%；生产强度为294.2 mg/（L·h），比已报道的重组枯草芽孢杆菌[30]的生产强度大；HA Mw约为7.22×104 Da（表3），相对于野生菌的HA Mw，有了大幅度的下降；Ip值约为1.31，说明重组菌SZh6ha在发酵时较好地保持了相对集中的分子量。在兽疫链球菌中表达LHAase和过表达HasA能提高碳通量流向透明质酸合成途径，最终达到提高透明质酸寡糖产量的目的，在透明质酸寡糖生产方面具有明显的优势。