《表2 shRNA干扰序列表Tab.2 The list of interfere sequence of shRNA》

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《siRNA沉默POLE2基因表达对非小细胞肺癌细胞增殖的影响》

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注:CCGG:Age I酶切位点；AATTC:EcoRI酶切位点；G:EcoRI酶切位点互补序列。Note:CCGG:Age I enzyme cutting site.AATTC:EcoRI enzyme cutting site.G:EcoRI enzyme cutting site complementary sequences.

按照RNAi设计原则[8]，以POLE2基因为模板，设计多个19~21 nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取干扰靶点序列（5'-GATTGTTCTTGGAATGATA-3'）。根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，在两端添加合适的限制性内切酶切位点，在正链3'端添加TTTTT终止信号，而反链5'端添加终止信号互补序列（表2）。将单链单寡核苷酸退火形成双链DNA，分别与经AgeⅠ和EcoRI双酶切后的GV115载体连接、转化、筛选构建和鉴定慢病毒介导的POLE2 siRNA表达载体GV115-sh POLE2。GV115-sh POLE2（20μg）、Helper1.0（15μg）、Helper2.0（10μg）分别与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，转移至含单层293T细胞的培养液中，培养48 h收集293T细胞上清液，4℃以0.45μm滤器过滤获得病毒粗提液，将病毒粗提液加入到Beckman超速离心机内，25 000 r/min离心2 h；样品杯中即为病毒浓缩液，采用稀释法确定病毒原液的滴度值[9]。倒置荧光显微镜观察转染效率，转染效率达80%以上的克隆进行下一步研究。