《表1 Ⅳ胶原酶活性测定的各孔成分组成Tab.1 The composition of each pore of typeⅣcollagenase activity determination》

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《Ⅳ型胶原酶模型的建立及其在中药活性成分筛选中的应用》

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96孔细胞板中，每孔加入100μl pH7.4 50mmol/LTris缓冲液（含10 mmol/LCaCl2、10μmol/L ZnCl2、0.05%月桂醇聚氧乙烯醚），依次加入5.0×10-5g/LⅣ型胶原酶溶液30μl、样品药液20μl，振摇混匀，室温放置10 min，再加入底物琥珀酰明胶溶液20μl，振摇混合均匀，37℃水浴中酶切反应30min。空白组以加热处理失活的酶代替酶标准品，并以等体积溶剂代替药液；阴性组以等体积溶剂代替药液（见表1）；为消除样品药液对吸光度值的影响，各样品药液设立相应的药物对照孔即不加酶和底物，其它操作相同，体积不足以去离子水补齐。然后每孔加入10μl 0.2 mol/L HCl终止酶切反应，再以10μl 0.2 mol/L NaOH调节体系pH至8.0，加入0.05%TNBS显色剂60μl，振摇，40℃水浴显色30min完全显色，冷却至室温后，360 nm处测定吸光度值。Ⅳ型胶原酶的抑制剂盐酸四环素作为阳性药随行对照[18]。实验每次每药液设置8个复孔，实验重复3次，计算抑制率（见表2）。