《表2 基因组测序用引物：S1基因结构解析与分子进化分析》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《S1基因结构解析与分子进化分析》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

注:引物名的数字代表在P0535G04克隆上位点（bp）的物理位置Note:The figures of the primer names indicate the physical positions（bp）on the PAC P0535G04

根据GenBank数据库中公布的‘日本晴’序列，设计相应的引物对（表2），并对IRAT216与IRAT216S1的基因组序列进行了扩增。引物对46221/50230、49793/53898、52631/58521相对应IRAT216-S1-j的基因组序列分3段的扩增成功（图3B）。IRAT216S1-S1-g由于差异较大分别用引物对46873/48430、48281/51682、49793/53405、53128/55361、5505/58521将其分成5段才扩增成功（图3A）。扩增反应体系20μL:2μL 10×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTP，正反向引物各0.25μmol/L，1 U Taq酶，20 ng模板DNA，补水至20μL。大部分片段采用常规三步扩增，反应程序如下:（1）94℃预变性3 min；（2）94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min/1 kb，30～35个循环；（3）72℃总延伸5 min。其中g1-PRO段是采用Touch-down PCR法，在68℃起始退火温度条件每隔一个循环降低0.5℃，40个循环后以48℃恒定退火温度下再扩增20个循环，最终才得到特异产物。所有扩增产物经过电泳检测后，加入1/10V的3mol/LNaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置20min，12000r/min离心10min，沉淀溶于水，定量后直接送PCR产物测序，或经相应酶切处理回收、连接于相应的酶切处理的载体上，测序后通过DNAMAN软件进行拼接与序列比对。