《表1 等电聚焦程序 (7cm p H 3-10 IPG胶条)》

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《基于双向电泳的蛋白质组学实验教学实践与探索》

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按照Bio-Rad公司的2-DE操作手册，由实验技术人员先配置好不含DTT和两性电解质的水化上样缓冲液，于-20℃保存，待学生实验时取出于室温解冻，准确称取加入DTT和p H3-10的两性电解质，充分混匀后，再分装给学生。具体操作如下:取180μL上述混合水化上样缓冲液，加入20μL大肠杆菌（E.coli BL21）的可溶性总蛋白（5mg/m L）充分混匀，离心除去气泡。从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm p H3-10），室温平衡10min。将样品沿着聚焦盘中槽的边缘由左至右线性加入，注意连续的加入，不要产生气泡。用镊子去除预制IPG胶条上保护层，将IPG胶条胶面朝下，从左至右轻轻置于聚焦盘样品溶液上，确保胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，此处也应特别提醒，不要产生气泡，同时不要将含有样品的溶液弄到胶条的支撑面上。在胶条上覆盖1m L矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序，最佳等电聚焦程序如表1所示。胶条聚焦结束后，立即进行平衡和第二向SDS-PAGE，或将胶条置于水化盘中，-20℃冰箱保存备用。