《表1 MLST分型用CD基因引物》

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《自建分子检测方法在腹泻患者艰难梭菌感染调查中的应用》

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参照文献[7]设计CD 7个管家基因的引物作为分型检测引物，见表1。对tpi阳性的粪便标本提取粪便DNA后进行CD 7个管家基因adk、dxr、atpA、tpi、sodA、glyA、recA的PCR扩增，测序后进行MLST分型。采用40μL的PCR反应体系，包括DNA模板2μL，上下游引物各1μL，premix rtaqDNA聚合酶20μL、ddH2O 16μL。扩增条件：95℃预变性15min；94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸70s，共35个循环，最后72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测电泳条带，然后将PCR产物测序，测序序列与数据库（http：//pubmlst.org/clostridium difficile）进行对比，得到特定位点的等位基因号，将等位基因组合形成相应的等位基因谱，与数据库进行比对后获得菌株型别。