《表2 PCR反应引物序列》

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《线粒体DNA4977bp大片缺失突变与喉癌的相关性研究》

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采用巢式PCR扩增缺失片段，检测引物序列见表1。反应体系；0.5U Taq酶、2.5 mmol/L Mg Cl2、250μmol/L d NTP、上下引物各0.5μmol/L、200 ng模板DNA，总共20μL。反应条件：首次循环94℃，3 min→55℃，3 min→72℃，1 min，剩余39次循环94℃，40s→55℃，40s→72℃，50s，再72℃，7 min延伸。野生型线粒体DNA保守片段引物序列见表2。PCR反应体系：0.5U Taq酶、2.5 mmol/L Mg Cl2、250μmol/L d NTP、上下引物各0.5μmol/L、200 ng模板DNA，总共20μL。反应条件：变性95℃，2 min→94℃，30s→55℃，30s→72℃，45s，循环40次，再72℃，7min延伸。取纯化后的巢式PCR产物及NDI基因片段与PGEM-T载体连接，电穿孔到大肠杆菌XL-1 Blue感受态细胞上，取含IPTG及X-Gal的转化菌涂布LB琼脂培养基，37℃过夜培养。次日选取白色菌落，置入含氨苄青霉素LB培养液内，37℃，300 r/min，恒温摇床内过夜。保种细菌后，采用质粒提取试剂盒将重组质粒提取出，并行荧光定量PCR扩增：以NDI基因为内参，引物序列为：线粒体DNA：上游引物：5'-CTTACACTATTCCTCATCACCCAACT-3'，下游引物：5'-TGATGTGGTCTTTGGAGTAGAAACC-3'，NDI：上游引物：5'-CTAGTTCGGACTCCCCTTCG-3'，下游引物：5'-CC-TAAAACCCGCCACATCTA-3'，反应体系：12.5μL SYBR EX Taq、0.5μL PCR上游引物、0.5μL PCR下游引物、4.0μL DNA样品、7.5μL dd H2O，总共25μL。反应条件：95℃，5 min→95℃，30s→55℃，30s→72℃，30s→60℃，2 min，循坏40次。