《表2 已报道的GDP-L-岩藻糖增强合成方法》

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《人乳寡糖2’-FL和3-FL的生物制备研究进展》

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Salvage途径具有技术局限性，原因是L-岩藻糖价格昂贵且难以获得，产业化难度较大[3]。相比较而言，De novo途径不引入L-岩藻糖而以葡萄糖或甘油为碳源合成2’-FL前体GDP-L-岩藻糖。显然，De novo途径的增产需要足够的胞内GDP-L-岩藻糖。为了实现过量积累，多个课题组优化了GDP-L-岩藻糖合成途径。Byun等[21]优化大肠杆菌de novo途径产GDP-L-岩藻糖的产量为55.2 mg/L，共表达了gmd、wca G、zwf三个基因；其中zwf基因属于磷酸戊糖途径，编码负责NADPH再生的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH），从而为Wca G催化的反应供应更多的NADPH。Lee等[22]通过在大肠杆菌中表达gmd、wca G、man B、man C获得了170.3 mg/L的GDP-L-岩藻糖含量，是仅表达gmd和wca G对照组的4.4倍，表明man B和man C的过表达较为重要。但继续表达man A并没有进一步增强GDP-L-岩藻糖的产量，表明该基因无需过表达。大肠杆菌的最高GDP-L-岩藻糖积累量为235.2 mg/L，是通过表达gmd、wca G、man B、man C、g6pdh、icd、mae B七个基因实现的，其中G6PDH、Icd、Mae B均负责产生还原力NADPH，十分有利于GDP-L-岩藻糖的积累[23]。Koizumi等[24]利用大肠杆菌和产氨短杆菌Corynebacterium ammoniagenes来混菌发酵，产氨短杆菌具有很强的转化GMP为GTP的能力，GTP被大肠杆菌中的Man C酶催化产生GDP-D-甘露糖，在经过Gmd和Wca G的作用形成GDP-L-岩藻糖，并通过Fuc T催化与N-乙酰-D-乳糖胺（Lac NAc）反应生成终产物Lewis X （也称CD15），这步反应释放的GDP再次通过产氨短杆菌转化为GTP；该混菌体系获得了惊人的18.4 g/L的反应中间体GDP-L-岩藻糖，最终收获了21 g/L的Lewis X，这为2’-FL和3-FL的大量合成提供了一种新思路，但混菌发酵较为复杂，研究难度大，因此尚未见更多的应用报道。3-FL的合成研究较2’-FL少，Jung等[25]通过表达幽门螺杆菌Fut A，实现了3-FL的从头生物合成（de novo），其表达宿主基于大肠杆菌BL21 star（DE3）?L-YA菌株，作者发现以甘油为碳源的3-FL产量要远高于葡萄糖为碳源，并且敲除了可拉酸合成途径的关键基因wca J后菌株?LW-YA中3-FL产量达到了11.5 g/L，摩尔得率0.39 mol/mol，产率0.22 g/（L·h）。Choi等[26]发现BL21（DE3）乙酸产生量更低，因此更适合生产3-FL。结合上述报道，2’-FL和3-FL的生物制备工艺总结为表1，对中间体GDP-L-岩藻糖的增强合成工艺总结为表2。