《表2 Golden gate cloning反应体系》

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《水稻多胚基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建》

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利用限制性核酸内切酶Bsa I识别位点与切割位点不重叠的特性，采用Golden gate cloning法构建双元载体[6-7]。选择适用于单子叶植物的p YLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体，p YLCRISPR/Cas9质粒使用Bsa I酶进行酶切，1μg的质粒反应30 min，反应温度37℃，获得线性化载体。然后T4DNA ligase对p YLCRISPR/Cas9质粒和上述g RNA表达盒进行连接，利用Golden gate cloning法将其克隆至p YLCRISPR/Cas9的Bsa I位点。反应体系见表2。