《表1 实验所用到的引物：半滑舌鳎hsd11b1l和hsd11b2基因的克隆及其温度响应的表达规律》

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《半滑舌鳎hsd11b1l和hsd11b2基因的克隆及其温度响应的表达规律》

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选取各样本高质量的RNA 1μg，利用Prime ScriptRT reagent Kit （Takara，日本）试剂盒反转录生成c DNA。设计hsd11b1l和hsd11b2的荧光定量检测引物（表1），进行实时荧光定量PCR （Real-time PCR）表达分析。使用Quanti Nova?SYBR Green PCR Kit （Qiagen，德国）试剂盒，反应体系为20μl，分别包含1μl c DNA模板、10μl SYBR Green PCR Master Mix （2×）、2μl QN ROX Reference Dye及0.7μmol/L的正向和反向引物。反应在ABI Step One Plus＿Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美国）进行，程序为95℃2 min；95℃5 s，60℃10 s，共40个循环；95℃5 s，60℃1 min，+1℃/min，95℃15 s。内参用β-actin基因片段（β-actin-q F/R，表1）。每个反应体系设置3个技术重复。使用2–ΔΔCt方法分析hsd11b1l以及hsd11b2基因在半滑舌鳎雌雄各组织、不同发育时期及温度处理样品中的表达水平（Livak et al，2001；Li et al，2010）。利用T-检验分析显著性，P<0.05表示差异显著。