《表3.预测的跨膜位点：十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物XopXccR1植物亚细胞定位》

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《十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物XopXccR1植物亚细胞定位》

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由于Xop Xcc R1分子量太大，经检索发现其编码基因没有合适的限制性内切酶酶切位点可用，无法通过一般的酶切连接来构建重组质粒，因此本研究通过Clon Express技术来获得重组质粒。Clon Express技术是一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。鉴于同源重组对引物要求的特殊性，在设计引物时，分别在插入片段的正/反向PCR引物的5′端引入了线性化载体的末端序列，使得PCR产物的5′端和3′端分别带有和线性化载体两末端一致的序列（15–20 bp）。以Xcc 8004总DNA为模板，Xop Xcc R1F/R、Xop Xcc R1N1-1220F/R和Xop Xcc R1C1221-2030F/R为引物，用高保真酶分别扩增得到含有载体p CAMBIA-2300-35S::EGFP酶切位点附近15 bp碱基的外源片段，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳证实，符合要求，分别得到长度为6135 bp、3702 bp和2475 bp的DNA片段（图2）。将经Bam H I/Xba I双酶切得到的线性化载体p CAMBIA-2300-35S::EGFP和已获得的外源DNA片段进行胶回收纯化，然后连接并转化E.coli DH5α。所得的转化子经菌体PCR验证，验证正确的转化子培养后提质粒并送公司测序，测序正确的Xop Xcc R1亚细胞定位表达重组质粒分别命名为P2300-35S::Xop Xcc R1-EGFP、P2300-35S::Xop Xcc R1N1-1220aa-EGFP和P2300-35S::Xop Xcc R1C1221-2030aa-EGFP。