《表1 AS-PCR引物：烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP功能标记开发与应用》

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《烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP功能标记开发与应用》

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注:ref1和ref2是引物设计的参考序列，ref1包含位点“G”，ref2包含位点“T”；1F-14F和CZ是正向引物，R1是反向引物，CZ是对照引物；随机替换下划线碱基得到不同的正向引物

Nt CPS2全长序列包含15个外显子和14个内含子。分子标记位于第4外显子，PCR产物长度为292 bp （图1），根据AS-PCR原理设计了一系列引物。SNP位点位于正向引物的最后一个碱基（表1），野生型位点为“G”，突变型位点为“T”。最后一个位点前的碱基被随机替换，从而得到不同的正向引物。其中1F-14F和CZ为正向引物，R1为反向引物，CZ为参考引物，每个正向引物仅匹配一个R1反向引物，组成不同的引物对。利用含有冷杉醇的材料Beinhart1000-1 （P1），包含野生型位点“G”和不含冷杉醇的材料Speight G-28 （P5），包含突变型位点“T”对这些引物进行筛选。从理论上讲，引物对1F/R1-7F/R1在P1中可以得到一个清晰的条带，在P2中没有条带，引物对8F/R1-4F/R1则相反。实际上，只有引物对1F/R1和8F/R1呈现的多态性较好（图2）。因此，1F/R1和8F/R1是区分野生型“G”和突变型“T”SNP的最佳选择。为了提高特异性，本研究对退火温度和循环次数进行了优化。