《表1 g RNA序列设计工具》

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《CRISPR/Cas9系统在作物基因组编辑中的研究进展》

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整个系统的构建只包括2个部分:Cas9蛋白和g RNA。Cas9蛋白和g RNA可分开构建到2个载体中，也可构建到1个载体中。这2种CRISPR/Cas9的构建方法各有优点，例如:将Cas9蛋白和g RNA构建在同一载体上可提高Cas9蛋白和g RNA的协同表达，这种构建方法适合于较难转染的作物，将Cas9蛋白和g RNA分开构建在2个表达载体上可以方便快速的对候选的g RNA进行打靶效率和脱靶情况检测（刘志国，2014）。Cas9蛋白构建时要对密码子优化，以使其能更好地表达，g RNA的设计也需通过靶标DNA序列设计（景润春和卢洪，2016）。CRISPR/Cas9打靶效率受很多因素的影响，通常SNP和环的循环越少，g RNA越有效，此外，干扰效率还可能与g RNA-DNA杂交体的解链温度密切相关，相对较高的AT含量与脱靶效应呈负相关，因此AT百分比越高脱靶效应越低（Mali et al.，2013）。因此g RNA序列的设计通常需要借助特定软件完成（表1）。不同的设计工是针对不同的作物基因组，如:E-CRISPRDesign、Cas-OFFinder、CRISPR-PLANT都适用于玉米基因组；Cas-OFFinder和CRISPR-PLANT可用于大豆基因组；CRISPRdirect和CRISPR-PLANT可用于高粱基因组；拟南芥和水稻等模式植物均可使用表中设计工具。华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室开发的CRISPR-P 2.0设计工具是植物中g RNA设计最流行的工具之一，提供了最新版本的基因组和注释的49种植物物种的g RNA，具有较低的脱靶效率，还提供了定制序列鉴定g RNA。如果用户的基因组序列未列在可选基因组中，用户可以上传自定义序列并鉴定g RNA（Liu et al.，2017）。