《表1 96孔板检测20份样品布局》

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《2018年肥东县春季猪口蹄疫免疫抗体水平检测与分析》

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检测依据—GB/T18935-2003。（1）洗涤液配制:将浓缩洗涤液（25×）用蒸馏水25倍稀释。（2）样品稀释液配制:将浓缩样品稀释液（5×）用蒸馏水5倍稀释。（3）稀释浓缩病毒抗原:使用配制好的洗涤液300倍稀释浓缩病毒抗原。（4）A1~A10，E1~E10孔各加175μL样品稀释液（1×），A11，A12，B12孔各加100μL的样品稀释液（1×），B1~B11，C1~C11，D1~D11，F1~F11，G1~G11，H1~H11，E11孔各加100μL的样品稀释液（1×）。（5）A1~A10，E1~E10孔各加25μL的待检样品，A11孔加100μL的阳性对照，A12孔各加100μL的阴性对照，吹打混匀，待检样品从A1~A10分别以100μL/孔的量从A到D连续2倍稀释，E1~E10分别以100μL/孔的量从E到H连续2倍稀释。（6）将以上稀释后的液体50μL/孔转移到包被板相应孔。（7）样品孔、阳性、阴性孔各加入稀释后的病毒抗原50μL/孔，E12，F12，G12，H12每孔加入100μL，37℃，温育30min。（8）取出，将各孔的液体弃入废液筒，用300μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次。每次洗涤后应弃去孔内液体。在最后1次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。（9）加入抗体溶液，50μL/孔，继续加酶结合物，50μL/孔，振荡混匀，贴封板膜，37℃，温育30min。（10）重复步骤（8），按加混合显色液100μL/孔（显色液A和显色液B按1:1混合），37℃避光温育15min。（11）每孔再加入50μL终止液，终止反应。测量并记录样品和对照的OD值（450nm），15min内读值有效。（12）试验成立判断。病毒抗原对照OD值应在2.0±1.0范围内；阳性对照抗体效价应在1∶1024±1滴度以内；阴性对照抗体效价应<1∶8。（13）结果判定:病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低OD值，计算剩余2孔的平均OD值，再除以2，既得50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD值。待检样品OD值>临界值，判为阴性；待检样品OD值≤临界值，判为阳性。