《表2 9 6 孔板单次检测81个样品的板布局Tab 2Single‐test panel layout of 81 samples with 96 holes》

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《基于高通量测序的2型糖尿病易感基因靶向测序panel设计及临床应用》

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3.针对易感基因检测panel的多重PCR设计:利用已知位点的RS号查询到SNP上下游序列，针对各个位点分别设计引物，通过NCBI的primer‐blast功能进行引物设计，片段大小范围190～210 bp，退火温度58℃～60℃，共得到针对21个位点的21对引物。利用MP primer在线软件评估多重PCR引物的特异性。每对上游与下游引物的5’端添加9组长度为10 bp的barcode序列用来分样，得到F1～F9组上游引物池及R1～R9组下游引物池，可同时在1个PCR的反应中对81个样品的21个位点进行扩增及后续的文库构建。将上述21对引物均稀释至10μmol/L后，分别将上游与下游引物混合，取10μl，得到9个上游引物池210μl及9个下游引物池210μl。首先配制PCR反应体系（50μl），DNA模板2μl（<1000 ng）；Q5 High‐Fidelity 2×MasterMix 25μl（NEB），上游引物2.5μl（10μmol/L），下游引物2.5μl（10μmol/L），去离子三蒸水18μl。其次设置PCR扩增参数设置，98℃预变性30 s，98℃变性10 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环。最后72℃延伸2 min，恢复至4℃。将多重PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳（150 V，30 min），通过紫外分析仪检测有清晰的目的条带后，将多重PCR产物进行纯化（德国耶拿PCR纯化试剂盒）及浓度测定。 （表2）