《表1 引物序列：重楼皂苷Ⅰ对结肠癌HCT116细胞FOXQ1及上皮间质转化的影响》

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《重楼皂苷Ⅰ对结肠癌HCT116细胞FOXQ1及上皮间质转化的影响》

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取对数生长期的HCT116细胞，分别加入重楼皂苷Ⅰ（1.25，2.50μmol·L-1），每皿10 mL，加入药物后继续培养24 h。同时设置不含药物、细胞培养液培养的空白组。M-PER?哺乳动物细胞裂解液裂解后提取总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定所提取的蛋白质浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，将蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，蛋白免疫印迹封闭液（含5%BSA）室温状态封闭3.5 h，分别加入FOXQ1（1∶2 000），E-c a d h e r i n(1∶1万），Vimentin(1∶1 000），β-actin(1∶1万），室温摇床孵育4 h；TBST洗涤15 min/次，洗涤3次，分别加入二抗，FOXQ1，E-cadherin，Vimentin组加入山羊抗兔（1∶5 000），β-actin组加入山羊抗小鼠（1∶5 000），室温摇床孵育1 h，TBST洗涤15 min次，洗涤2次，TBS洗涤15 min，加入适量增强化学发光法发光试剂，在凝胶成像仪中显影后得到蛋白条带图，软件Image J进行分析。实验重复3次。2.3 Real-time PCR检测FOXQ1，E-cadherin，Vimentin mRNA的表达酚-三氯甲烷法提取高、低浓度重楼皂苷Ⅰ组、空白组细胞总RNA，进行RNA定量分析，按cDNA逆转录试剂盒说明书进行总RNA逆转录实验，逆转录条件：37℃30 min，85℃20 s，-20℃保存。以cDNA以模板，与基因特异性引物，通过PCR扩增FOXQ1，E-cadherin，Vimentin，扩增条件：94℃30 s，1个循环；94℃5 s，59℃30 s，40个循环；95℃2 s，60℃15 s，95℃2 s，1个循环；50℃保存。检测分析解离曲线，确保只有单一产物被扩增；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，利用ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt内参基因；ΔΔCt=ΔCt最低样本-ΔCt其他样本，RQ=2-ΔΔCt对被扩增基因进行相对定量分析，引物序列见表1。实验重复3次。2.4统计学分析采用GraphPad prism 6软件进行统计分析，计量数据采用xˉ±s表示，数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布及方差齐性，采用单因素方差分析，并采用最小显著性差异法（LSD）进行两两比较；不符合正态分布、方差分析，采用Kruska-Wallis H进行统计处理。P<0.05为差异具有统计学意义。