《表5.Trim-Away介导的蛋白功能干扰部分应用案例》

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《哺乳动物雌性生殖细胞及早期胚胎基因敲除或敲减的方法》

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与其他基于抗体的干扰技术一样，抗体的特异性对于Trim-Away实验的成功至关重要。一个特异性强的抗体能够降解所有带有目标表位的抗原（即靶点），但不能降解无关的抗原（即靶外抗原）。当选择抗体的时候应该注意以下几点。第一，抗体来源物种。在小鼠、犬、灵长类动物中，TRIM21与抗体的相互作用高度保守[103]。在相同的TRIM21浓度下，该方法敲除小鼠、兔和山羊细胞内的抗绿色荧光蛋白的效率没有差异。但是，TRIM21不能与鸡来源的抗体结合[95]。因此，在实际应用前，研究人员应该对不常见宿主的抗体进行检测。第二，TRIM21与IgG的亲和力最高，其次是IgM和IgA，不与IgY结合[104]。TRIM21与IgD或IgE的结合能力尚不清楚。第三，抗体的结构，商品化抗体可以选择多种结构，包括全长的Ig、Fab和Fab2。由于TRIM21与抗体的Fc-区域结合，所以应该避免使用Fab和Fab2。考虑到纳米抗体的广泛应用，Clift等人还成功地将纳米抗体与人IgG1的Fc区融合用于Trim-Away实验[95]。第四，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，均能有效应用于Trim-Away实验。但是由于多克隆抗体之间存在差异，使用单克隆抗体可以得到更加稳定和可重复的结果。最后，研究表明，只要有特异性抗体存在，Trim-Away还可以用于选择性地降解翻译后修饰的蛋白。然而，这些抗体必须在使用前仔细评估。例如，在小鼠卵子中，磷酸化的动粒蛋白多克隆抗体在类微管组织中心存在非特异性结合[105]。鉴于抗体在Trim-Away实验中的重要性，需要进行预实验来验证抗体的有效性，包括与荧光标签蛋白共定位实验、免疫荧光染色定位实验、蛋白印迹实验、与其他方法的交叉验证等。