《表1 IR相关基因序列：滇结香花提取物组分1(Fr.1)对C2C12肌细胞胰岛素抵抗的改善作用》

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《滇结香花提取物组分1(Fr.1)对C2C12肌细胞胰岛素抵抗的改善作用》

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将对数生长期的细胞以5×104个/孔的密度铺于96孔黑色荧光板，细胞长至80%后换为分化培养基培养5～7 d，隔天换液，待细胞分化为肌细胞后，换含2%BSA的无酚红高糖DMEM培养基培养12 h，换以含不同质量浓度Fr.1(12.5、25、50、100μg/mL）及含0.75 mmol/L PA的2%BSA无酚红高糖DMEM培养基培养16 h，每组6个平行，100 nmol/L Ins作用30 min后，检测方法同1.2.5。1.2.9实时荧光定量PCR(RT-PCR）检测IR相关基因的表达采用苯酚抽提法提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA，采用荧光染料FastStart Universal SYBR Green Master(ROX）进行荧光定量PCR反应，用2-△△t法[12]对IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKαm RNA的表达水平进行相对定量，采用的引物见表1。1.2.10蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测IR相关蛋白质的表达细胞加药作用后，预冷的DPBS漂洗细胞，每皿加入100μL蛋白质裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制剂），在冰上裂解30 min，将细胞刮下收集于1.5 mL离心管中，12 000 g、4℃离心10 min，取蛋白质上清液，BCA试剂盒测样品的蛋白质浓度。经10%的SDS-PAGE电泳湿法转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后，4℃过夜孵育一抗，常温孵育二抗1 h，显色拍照，通过Image J软件分析蛋白质条带，定量检测p-IRs、p-IRS-1[10]、Glut4[13]以及AKT[14]、AMPK[13]信号通路蛋白质的表达。