《表2 扩增Target序列的引物》

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《RIG-I敲除293T细胞系的建立及其对B型流感病毒复制的影响》

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以293T细胞基因组DNA为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增sgRNA靶位点上下游间的一段长约400–500 bp的序列作为target，扩增引物如表2所示。PCR产物测序验证后与线性化的precut pUCA（Luc）质粒连接，构建重组载体pUCA（Luc）-target，以用于Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1的向导及切割（sgRNA/Cas9）活性检测。连接体系如下：纯化的PCR片段（target）4μL，precut pUCA（Luc）质粒1μL，T4 DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶缓冲液1μL，ddH2O 3μL。连接条件为16℃连接过夜。将连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α中，卡那抗性筛选阳性克隆并接种至卡那抗性的液体LB培养基，利用质粒提取试剂盒进行质粒提取并测序验证是否为正确的重组质粒。