《表2 谷氨酸脱羧酶0645的PCR引物》

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《重组大肠杆菌高效催化合成γ-氨基丁酸》

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a:下划线部分为酶切位点；斜体部分为保护碱基。

采用细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取E.coli K-12的基因组DNA。基于NCBI网站GenBank数据库中的谷氨酸脱羧酶（GAD）基因序列（WP＿000358930.1）设计引物，如表1所示，其中包含合适的限制性酶切位点和保护碱基。以E.coli基因组DNA为模板，以Gad-UP和Gad-Down为上下游引物，在DNA聚合酶的作用下通过聚合式酶连反应（PCR）扩增获得目标基因。PCR条件:98℃5 min，30×（98℃1 min，58℃1 min，72℃1 min），72℃10 min。PCR产物和质粒p ET28a经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，再经T4连接酶16℃条件下连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含有50μg/m L的LB固体培养基平板上筛选阳性克隆。阳性克隆通过双酶切和PCR验证后，进行DNA测序确认，从而得到重组表达质粒pET-GAD，进一步转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，用于重组谷氨酸脱羧酶的表达。