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目 录1

前 言1

1 分子生物学基础1

2 分子生物学家的实验方法5

3 使用本书的一般准备、步骤及注意事项11

§3.1如何使用本书11

§3.2安全注意事项15

§3.3分子生物学研究所需要的设备16

4 克隆载体与细菌细胞20

§4.1 pBR32220

§4.2 M1322

§4.3 pUC25

§4.5 λgt1127

§4.4 λgt1027

§4.6 EMBL3和EMBL429

§4.7 Charon2830

§4.8细菌菌株32

5 真核细胞DNA的制备33

§5.1 DNA的快速制备33

§5.2真核细胞DNA的制备——一般方法35

§5.3培养细胞和组织的DNA制备37

§5.4限制性核酸内切酶（REs）及其应用41

§5.5琼脂糖凝胶电泳48

§5.6 Southern印迹51

6 用标记的合成探针探测核酸55

§6.1制备合成DNA探针——总论55

§6.2合成探针的末端标记59

§6.3用合成的32P末端标记探针进行杂交61

§7.1 缺口转译66

7 用质粒源性探针探测核酸66

§7.2 DNA杂交（Southern印迹杂交）69

8 质粒DNA的制备73

§8.1细菌的转化73

§8.2质粒DNA制备：三硝基甲苯—溶菌酶76

（Triton—Lysozyme）法76

§8.3大规模碱裂解法：质粒纯化82

§8.4质粒“微量制备”法85

9DNA内切酶片段的制备88

§9.1微型凝胶（Minigels）88

§9.2酶切后DNA片段的分析90

——琼脂糖凝胶电泳90

§9.3 电洗脱93

§9.4 DNA限制性片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳96

§10.1 DNA的精胺纯化法100

10 DNA的纯化100

§10.2 DNA的玻璃粉洗脱102

§10.3 DNA的纯化：其它方法104

11 真核细胞RNA的制备和分析108

§11.1用喹尼丁异硫氰酸盐制备细胞总RNA108

§11.2微量RNA制备法114

§11.3用Oligo（dT）纤维素柱制备Poly（A+）RNA116

§11.4福尔吗啉凝胶电泳分离RNA和Northern印迹分析120

§11.5用标记的探针“打点”杂交检测DNA或RNA124

§11.6 RNA杂交时一般注意事项127

§11.7体外转录克隆到质粒中的DNA插入片段制备RNA探针128

12 噬菌体克隆DNA的制备133

§12.1噬菌体的扩增与制备133

§12.2噬菌体DNA的大量制备与提纯136

13 从真核细胞基因组中克隆DNA142

§13.1概述142

§13.2 DNA制备： MboI部分消化法144

§13.3基因克隆的噬菌体载体的制备148

§13.4连接基因组DNA和噬菌体的臂、包装、构建基因文库153

§13.5基因文库的滴度测定和平皿试验155

§13.6用放射性标记的探针筛选基因文库158

§13.7基因文库扩增163

14 用λgt10和λgt11克隆cDNA166

§14.1制备cDNA克隆载体——λgt10和λgt11166

§14.2从真核细胞mRNA制备cDNA插入片段172

§14.3λgt10或λgt11臂的连接、包装与cDNA181

文库的构建181

§14.4包装后的重组λgt10和λgt11的平皿接种183

与筛选183

§14.5 λgt10和gt11cDNA克隆DNA的制备188

15 用质粒载体进行亚克隆192

§15.1用质粒载体进行亚克隆：总则192

质粒的制备193

§15.3 pBR322集落杂交199

§15.4用pUC质粒载体进行亚克隆201

16 M13克隆与序列分析204

§16.1 M13克隆及序列分析：概况204

§16.2用内切酶制备克隆插入片段210

§16.3用BAL31外切核酸酶连续删节法制备M13克214

隆插入片段214

§16.4 M13载体制备及载体与插入片段的连接218

§16.5用M13转化大肠杆菌JM103222

§16.6用放射性探针筛选M13克隆挑选插入片段作序列分析224

§16.7制备M13单链DNA用于序列分析226

§16.8 M13克隆的单道（Sinle-lane）筛选228

§16.9聚丙烯酰胺序列分析凝胶的制备231

§16.10 M13克隆序列分析235

17 克隆DNA的进一步定性241

§17.1 S1核酸酶保护试验241

18 哺乳动物体外培养细胞的转染试验251

§18.1用纯化质粒进行悬浮细胞和贴壁细胞转染的磷酸钙沉淀法251

§18.2 DEAE葡聚糖介导的哺乳动物悬浮细胞和贴壁细胞的转染试验255

§18.3电导入（Electroporation）257

§18.4转染后哺乳动物细胞的选择——G418选择方法260

§18.5氯霉素乙酰转移酶试验（CAT试验）262

19 蛋白质的分析方法266

§19.1体外翻译和免疫沉淀266

§19.2聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质270

§19.3 Western印迹分析法275

§19.4蛋白质和RNA凝胶的银染色278

20 一般的方法282

§20.1 DNA和RNA的抽提和沉淀282

§20.2塑料袋封口285

§20.3光密度分析测量287

§20.4凝胶或放射自显影的照相288

§20.5放射自显影术289

§20.6细菌生长平板的制作291

§20.7噬菌体的滴度测定与铺板294

21 特殊的方法296

§21.1转基因小鼠制备296

§21.2单克隆抗体生产：杂交瘤融合304

§21.3标记探针与组织切片的原位杂交311

§21.4克隆至酵母菌316

附录1． 母液319

§15.2插入片断的亚克隆与连接中的pBR322

2．酶类326

3． 提供试剂和仪器的主要厂商327