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第一章细胞培养基本知识1

1.1 前言1

1.2培养细胞的特性5

1.2.1培养细胞的生长方式及类型5

1.2.1.1 贴附生长型细胞5

1.2.1.2 悬浮生长型细胞7

1.2.2培养细胞的生长特点7

1.2.2.1 贴附7

1.2.2.2 接触抑制及密度依赖性8

1.2.3培养细胞的生长过程9

1.2.3.1 单个细胞的生长过程9

1.2.3.2 细胞系的生长过程12

1.2.3.3 每代细胞的生长过程15

1.3培养细胞生长的条件17

1.3.1细胞的营养需要17

1.3.1.1 基本营养物质17

1.3.1.2 促生长因子等物质18

1.3.2 细胞的生存环境19

1.3.3 无污染及无毒21

第二章细胞培养室的设置、设备和准备工作22

2.1细胞培养实验室的设置及设备22

2.1.1细胞培养实验室的设置22

2.1.1.1 无菌操作区22

2.1.1.2 孵育区25

2.1.1.3 制备区25

2.1.1.4 储藏区25

2.1.1.5 清洗和消毒灭菌区25

2.1.2细胞培养实验室的设备25

2.1.2.1 常用的基本设备25

2.1.2.2 特殊设备30

2.2培养用品的清洗和消毒灭菌31

2.2.1 培养用品的清洗31

2.2.2培养用品的消毒灭菌34

2.2.2.1 消毒灭菌的方法34

2.2.2.2 消毒方法的选择39

第三章细胞培养用液及培养基（液）40

3.1培养用液40

3.1.1 水40

3.1.2 平衡盐溶液41

3.1.3 消化液42

3.2培养基（液）43

3.2.1 天然培养基43

3.2.2合成培养基（液）46

3.2.2.1 合成培养基（液）基本成份46

3.2.2.2 常用的合成培养基（液）47

3.2.2.3 合成培养基（液）的配制53

3.2.2.4 无血清培养基（液）55

第四章细胞培养的基本技术58

4.1基本操作技术和要求58

4.1.1 培养室内的无菌操作58

4.1.2培养细胞的取材60

4.1.2.1 取材的基本要求60

4.1.2.2 取材的基本器材和用品61

4.1.2.3 皮肤和粘膜的取材61

4.1.2.4 内脏和实体瘤的取材61

4.1.2.5 血细胞的取材62

4.1.2.6 骨髓、羊水、胸水、腹水内细胞的取材62

4.1.2.7 鼠胚组织的取材62

4.1.2.8 鸡胚组织的取材62

4.1.3组织材料的分离63

4.1.3.1 细胞悬液的分离方法63

4.1.3.2组织块的分离方法63

4.1.3.2.1 机械分散法63

4.1.3.2.2 剪切分离法64

4.1.3.2.3 消化分离法64

4.2原代培养68

4.2.1 组织块培养法69

4.2.2 消化培养法71

4.2.3 器官培养72

4.3传代培养和细胞系的维持73

4.3.1 原代培养的首次传代73

4.3.2 细胞传代方法74

4.3.3 细胞系的维持75

4.3.4培养细胞的纯化76

4.3.4.1 自然纯化76

4.3.4.2人工纯化77

4.3.4.2.1 酶消化法77

4.3.4.2.2 机械划除法77

4.3.4.2.3 反复贴壁法78

4.3.4.2.4 克隆法78

4.3.4.2.5 培养基限定方法79

4.3.4.2.6 流式细胞仪分离法79

4.4细胞冻存与复苏79

4.4.1 细胞的冻存79

4.4.2 细胞的复苏82

4.4.3 培养细胞的运输83

4.5细胞培养污染的检测和排除84

4.5.1 微生物污染的途径84

4.5.2 微生物污染对细胞的影响85

4.5.3 微生物污染的检测85

4.5.4 微生物污染的防治88

4.5.5 细胞交叉污染88

第五章正常组织细胞的培养90

5.1上皮细胞的培养90

5.1.1 表皮90

5.1.2 乳腺93

5.1.3 子宫颈95

5.1.4 肝98

5.1.5 胰100

5.1.6 肾102

5.1.7 气管及支气管102

5.1.8 前列腺104

5.1.9 口腔粘膜上皮105

5.2中胚层细胞的培养107

5.2.1 结缔组织细胞107

5.2.2 脂肪组织细胞107

5.2.3 肌肉组织细胞107

5.2.4 软骨细胞109

5.2.5 骨细胞111

5.2.6成骨细胞111

5.2.6.1 骨组织块培养法111

5.2.6.2 骨膜组织块培养法112

5.2.6.3 酶消化培养法112

5.2.6.4 骨髓培养法114

5.2.6.5 成骨细胞的传代培养115

5.2.6.6 培养的成骨细胞鉴定115

5.2.7破骨细胞116

5.2.7.1 四肢长骨机械分离法116

5.2.7.2 下蛋母鸡长骨分离法117

5.2.7.3 颅盖骨消化法117

5.2.7.4 骨髓单个核细胞培养法118

5.2.7.5 培养的破骨细胞鉴定119

5.2.8 内皮细胞119

5.3神经外胚层细胞的培养121

5.3.1 神经原细胞121

5.3.2 神经胶质细胞122

5.3.3 黑色素细胞123

5.4 血细胞的培养125

第六章肿瘤细胞的培养127

6.1肿瘤细胞的取材和培养127

6.1.1 肿瘤细胞的取材方法127

6.1.2 肿瘤细胞的培养方法及注意事项128

6.2培养肿瘤细胞的生物学鉴定129

6.2.1 常用培养肿瘤细胞的生物学检查项目129

6.2.2 人的恶性肿瘤细胞连续性细胞系（株）的建系（株）标准130

6.3抗癌药物敏感性试验134

6.3.1 试验药物储备液的配制134

6.3.2 受试细胞的准备135

6.3.3 药物疗效的评价135

6.3.4药物敏感性试验136

6.3.4.1体外药物敏感试验136

6.3.4.1.1 美蓝法136

6.3.4.1.2 染料排斥试验法136

6.3.4.1.3 生长曲线测定法136

6.3.4.1.4 集落形成试验法137

6.3.4.1.5 四唑盐（MTT）比色法138

6.3.4.1.6 三磷酸腺苷生物发光法138

6.3.4.1.7 放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法141

6.3.4.1.8 3H-亮氨酸掺入细胞蛋白质试验法141

6.3.4.1.9 抗癌药的效能比测定法141

6.3.4.2体内抗癌药物敏感试验142

6.3.4.2.1 裸鼠移植瘤试验142

6.3.4.2.2 小鼠肾包膜下肿瘤移植试验143

6.4 裸鼠移植瘤动物模型144

6.5肿瘤放射生物学实验模型147

6.5.1肿瘤放射生物学培养细胞实验模型148

6.5.1.1研究方法148

6.5.1.1.1 单层培养细胞实验技术148

6.5.1.1.1.1 细胞克隆（集落）计数法148

6.5.1.1.1.2 四唑盐比色法（MTT法）148

6.5.1.1.2 离体培养细胞的乏氧照射技术149

6.5.1.1.3 离体多细胞球体实验技术150

6.5.1.2放射生物学中细胞存活曲线的数学模型151

6.5.1.2.1 简单的多靶单击模型151

6.5.1.2.2 带初斜率的多靶单击模型152

6.5.1.2.3 线性平方模型153

6.5.2肿瘤放射生物学的实体瘤整体水平实验模型153

6.5.2.1 肿瘤生长测定155

6.5.2.2 50％肿瘤控制剂量（TCD50）测试155

6.5.2.3 体内稀释分析技术155

6.5.2.4 肺克隆测试156

6.5.2.5 体内-体外分析技术156

6.6肿瘤侵袭模型156

6.6.1体内侵袭模型156

6.6.1.1 皮下移植侵袭模型157

6.6.1.2 肌肉内移植侵袭模型157

6.6.1.3 腹腔内移植侵袭模型157

6.6.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型157

6.6.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型157

6.6.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型158

6.6.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型158

6.6.1.8 视网内界膜侵袭模型158

6.6.2体外侵袭模型158

6.2.2.1体外静止器官培养法158

6.2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法158

6.2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法159

6.6.2.2 半体外半体内器官培养法159

6.6.2.3 单层细胞器官培养法160

6.6.2.4瘤细胞球体器官培养法161

6.6.2.4.1 静止球体器官培养法161

6.6.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法161

6.6.2.5 单层细胞侵袭实验模型162

6.7 肿瘤转移模型162

6.8肿瘤细胞分化诱导模型164

6.8.1体外分化诱导模型164

6.8.1.1 白血病细胞分化诱导模型164

6.8.1.2实体瘤分化诱导模型166

6.8.1.2.1 人粘液表皮样癌MEC-1细胞分化诱导实验166

6.8.1.2.2 人肝癌Bel-7402细胞分化诱导实验167

6.8.1.2人结肠癌HT-29细胞分化诱导实验167

6.8.1.2.4 人神经母细胞瘤LA-N-1细胞分化诱导实验167

6.8.1.2.5 人黑色素瘤细胞分化诱导实验167

6.8.2 体内分化诱导模型167

第七章培养细胞生长状况的观察169

7.1 培养细胞的常规观察169

7.2活细胞的观察171

7.2.1 培养细胞的相差显微镜观察171

7.2.2 培养细胞的动态观察173

7.3细胞生长状况的观察173

7.3.1 细胞计数173

7.3.2 细胞生长曲线175

7.3.3 细胞分裂指数177

7.3.4 细胞贴壁率179

7.3.5 细胞周期179

第八章细胞培养中的研究方法181

8.1细胞活力的检测方法181

8.1.1染料排除法181

8.1.1.1 台盼蓝排斥试验181

8.1.1.2 伊红Y排斥试验182

8.1.1.3 苯胺黑排斥试验182

8.1.2克隆（集落）形成试验183

8.1.2.1 平板克隆形成试验183

8.1.2.2 软琼脂克隆形成试验184

8.1.3 四唑盐（MTT）比色试验186

8.1.4 三磷酸腺苷发光试验187

8.1.5 细胞蛋白质含量测定法188

8.1.6 细胞蛋白质合成测定法189

8.2细胞遗传学的检测方法191

8.2.1 细胞DNA染色法191

8.2.2 细胞DNA含量测定法192

8.2.3 细胞DNA合成测定法193

8.2.4 常用染色体显示法194

8.2.5 染色体显带法196

8.3细胞形态学的研究方法198

8.3.1 培养细胞的HE染色方法198

8.3.2培养细胞的免疫组织化学染色技术200

8.3.2.1 免疫荧光染色方法200

8.3.2.2 ABC免疫酶染色方法202

8.3.2.3 注意事项203

8.3.3 培养细胞嗜银蛋白（AgNORs）分析204

8.3.4培养细胞的电镜检测技术206

8.3.4.1 培养细胞的透射电镜样品制备技术206

8.3.4.2 培养细胞的扫描电镜样品制备技术209

第九章有关的部分实验技术211

9.1细胞的分离技术211

9.1.1 梯度沉降分离法211

9.1.2 等密度沉降分离法213

9.1.3 流式细胞仪分离法217

9.2细胞器的分离技术217

9.2.1 破碎细胞的方法217

9.2.2部分细胞器的分离方法218

9.2.2.1 细胞核的分离219

9.2.2.2 细胞膜的分离221

9.2.2.3线粒体及线粒体膜的分离222

9.2.2.3.1 线粒体的分离222

9.2.2.3.1 线粒体膜的分离222

9.2.2.4 聚核糖体的分离224

9.2.2.5 微粒体的分离225

9.2.2.6 溶酶体的分离226

9.3细胞克隆技术227

9.3.1 有限稀释法227

9.3.2 平皿克隆分离法229

9.3.3 软琼脂克隆分离法230

9.3.4 单细胞显微操作法230

9.4杂交瘤技术232

9.4.1 杂交瘤技术的基本原理232

9.4.2 杂交瘤技术的主要用品234

9.4.3 骨髓瘤突变缺陷细胞株的选择与传代培养236

9.4.4 免疫脾细胞的制备236

9.4.5 饲养细胞的制备237

9.4.6 细胞融合实验238

9.4.7 单克隆抗体的检测239

9.4.8 克隆化培养240

9.4.9 单克隆抗体的大量制备241

9.4.10 杂交瘤细胞染色体的鉴定241

9.4.11 单克隆抗体的鉴定242

第十章有关的部分分子生物学技术243

10.1基本分子生物学技术243

10.1.1 培养细胞基因组DNA的提取243

10.1.2提取DNA鉴定245

10.1.2.1 DNA纯度检测及含量计算245

10.1.2.2 DNA分子量大小鉴定246

10.1.3 培养细胞总RNA的提取247

10.1.4提取RNA鉴定249

10.1.4.1 RNA纯度检测及含量计算249

10.1.4.2 RNA分子量大小鉴定249

10.1.5DNASouthernBlot及杂交250

10.1.5.1 洋品DNA内切酶水解250

10.1.5.2 SouthernBlot及杂交252

10.1.6 N0rthernBlot及杂交255

10.1.7 WesternBlot及分析256

10.2培养细胞的原位杂交258

10.2.1 载玻片和盖玻片预处理259

10.2.2 组织细胞固定260

10.2.3探针制备261

10.2.3.1同位素DNA探针标记261

10.2.3.1.1 随机引物延伸法261

10.2.3.1.2 缺口平移标记法263

10.2.3.1.3 体外RNA探针合成及标记264

10.2.3.2非同位素探针标记267

10.2.3.2.1 核酸光敏生物素标记267

10.2.3.2.2 DNA地高辛标记268

10.2.4原位杂交269

10.2.4.1 同位素标记DNA探针的原位杂交269

10.2.4.2 同位素标记RNA探针的原位杂交271

10.2.4.3 地高辛标记的DNA探针原位杂交272

10.2.5 洗涤273

10.2.6 设计对照274

10.3细胞的基因转移274

10.3.1 磷酸钙-DNA共沉淀法276

10.3.2 DEAE—葡聚糖法278

10.3.3 脂质体载体介导DNA转移279

10.3.4逆转录病毒载体介导DNA转染281

10.3.4.1可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立281

10.3.4.1.1 逆转录病毒载体进入包装细胞系281

10.3.4.1.2 病毒滴度鉴定283

10.3.4.2 原代培养正常上皮细胞的逆转录病毒转染285

10.3.5转染细胞鉴定286

10.3.5.1 被转移DNA检测287

10.3.5.2 免疫组织化学染色287

10.3.5.3 软琼脂培养287

10.3.5.4 转染细胞致瘤性检测288

第十一章有关的部分仪器分析技术289

11.1显微分光光度计289

11.1.1 显微分光光度计的基本结构289

11.1.2显微分光光度术290

11.1.2.1 基本原理290

11.1.2.2 使用步骤291

11.1.2.3 应用举例293

11.1.3显微荧光光度术293

11.1.3.1 基本原理293

11.1.3.2 使用步骤294

11.1.3.3 应用举例297

11.2流式细胞仪298

11.2.1 流式细胞仪的结构和原理298

11.2.2流式细胞仪的使用步骤299

11.2.2.1样品制备299

11.2.2.1.1 制备单个细胞悬液299

11.2.2.1.2 样品固定300

11.2.2.2样品染色和检测300

11.2.2.2.1 活细胞荧光染色300

11.2.2.2.2 DNA显示法301

11.2.2.2.3 DNA和RNA双重染色301

11.2.2.2.4 DNA与蛋白质双重染色302

11.2.2.2.5 DNA与癌基因标本双标记测定302

11.2.2.3 注意事项303

11.2.3 应用举例304

11.3激光共焦细胞仪305

11.3.1 激光共焦细胞仪的结构和原理305

11.3.2 激光共焦细胞仪的使用步骤307

11.3.3 应用举例307

11.4图像分析系统309

11.4.1 图像分析系统的结构和原理309

11.4.2 图像分析系统的使用步骤310

11.4.3 应用举例311

附录312