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原理篇2

纵览2

对多种细菌进行遗传学分析3

0.1开头的话4

0.2.2 基因转移系统5

0.2.1 诱变5

0.2 近期目标5

0.2.3 限制和修饰系统6

0.3.1 自杀载体7

0.3 中期目标7

0.2.4 反选择7

0.4.2 普遍性转导8

0.4.1 物理作图8

0.3.2 互补分析8

0.4 远期目标8

1.1 细菌致病机制的一般概念9

第一章 细菌的致病机制9

1.2.1.1 沙门氏菌属分类13

1.2.1 鼠伤寒沙门氏菌13

1.2 细菌致病机制各论13

1.2.1.3 毒力机制14

1.2.1.2 沙门氏菌感染14

1.2.1.4 注意15

1.2.2.1 霍乱毒素16

1.2.2 霍乱弧菌16

1.2.1.5 鼠伤寒沙门氏菌LT2株16

1.2.2.3 定居因子17

1.2.2.2 其他毒素17

1.2.2.4 毒力因子的胞外分泌18

1.2.2.5 毒力基因表达的调控19

2.1.1 基因型与表现型21

2.1 遗传学术语21

第二章 微生物遗传学的实践方面21

2.1.3 等位基因的编号22

2.1.2 基因与操纵子22

2.1.7 融合23

2.1.6 插入23

2.1.4 菌株的命名23

2.1.5 缺失23

2.1.10 基因图谱和物理学图谱24

2.1.9 定位缺失和重复24

2.1.8 可抑制性突变和条件性突变24

2.2.1.2 单个菌落的纯化25

2.2.1.1 液体培养基的接种25

2.2 微生物学操作25

2.2.1 基本细菌学技术25

2.2.1.4 大量的液体培养26

2.2.1.3 涂平板26

2.3.1 确定成分培养基27

2.3 培养基27

2.2.1.5 倍数稀释27

2.2.1.6 影印培养27

2.3.2 复合培养基28

2.3.4.1 四氮唑培养基29

2.3.4 鉴别培养基29

2.3.3 特殊复合培养基29

2.3.3.1 Luria-Bertani肉汤29

2.3.3.2 营养肉汤29

2.3.5 XGal30

2.3.4.2 麦康凯琼脂培养基30

2.3.6 XP31

2.3.8.2 EBU培养基32

2.3.8.1 绿色培养基32

2.3.7 在lac遗传学中有用的化合物32

2.3.8 P22溶原菌的指示培养基32

2.4.1 正选择与负选择33

2.4 抗生素、抗生素抗性、正选择与负选择33

2.3.9 选择性培养基33

2.3.9.1 萎蔫酸培养基33

2.4.3 氨基糖甙类抗生素34

2.4.2 表现型的表达34

2.4.4 氨苄青霉素35

2.4.3.1 一种负选择方法35

2.5 细菌生理学36

2.4.7 蔗糖抗性:一种负选择方法36

2.4.5 氯霉素36

2.4.6 四环素36

2.4.6.1 一种负选择方法36

2.5.2 培养物的生长37

2.5.1 生理学与代谢37

2.5.2.3 监视培养物的密度38

2.5.2.2 通气38

2.5.2.1 培养基的选择38

2.5.3 酶活性的测定39

2.5.4 酶合成差率的测定40

3.1.1 利用接合和转导技术绘制遗传图谱42

3.1 染色体基因的遗传作图42

第三章 遗传作图42

3.1.2.1 物理图谱和遗传图谱的关系43

3.1.2 物理作图43

3.1.3 鼠伤寒沙门氏菌的Mud-P22作图44

3.1.2.2 物理作图的实际应用44

3.2 普遍性转导46

3.2.1.1 P22的调节和包装47

3.2.1 P22噬菌体47

3.2.1.2 P22介导的普遍性转导48

3.2.1.3 P22 HT（高频转导）突变体49

3.2.1.4 P22的溶源性和超感染排斥50

3.2.2 把P22的宿主范围扩展到其他细菌52

3.2.1.5 P22介导的质粒转导52

3.2.4 转导噬菌体的分离53

3.2.3 PI噬菌体53

3.3.1 根据共转导数据确定遗传连锁和基因顺序54

3.3 利用普遍性转导技术进行遗传作图54

3.3.2 共转导频率和物理距离之间的关系57

3.4 缺失作图58

3.3.4 影响遗传连锁的因素58

3.3.3 改良的转导作图公式58

3.4.2 定向缺失60

3.4.1 缺失作图的实际应用60

4.1 诱变62

第四章 突变体及其分析62

4.1.2 突变的类型63

4.1.1 何为突变?63

4.1.3.2 遗传学筛选65

4.1.3.1 遗传学选择65

4.1.3 突变体的分离65

4.1.4.1 自发诱变66

4.1.4 诱变66

4.1.5 诱变剂67

4.1.5.2 烷化剂68

4.1.5.1 碱基类似物诱变剂68

4.1.6 DNA修复69

4.1.5.5 紫外线69

4.1.5.3 氧化剂69

4.1.5.4 嵌入剂69

4.1.7 增变株70

4.1.6.1 易错修复70

4.1.8.2 应用核酸酶和PCR构建突变71

4.1.8.1 定域诱变71

4.1.8 体外诱变71

4.1.8.3 定点诱变72

4.1.9 随机和定向诱变76

4.2.1 在选择性标记交换中质粒不相容性的应用77

4.2 广宿主范围的等位基因交换系统77

4.2.3 利用自杀载体进行非选择突变的等位基因交换79

4.2.2 利用条件性复制子（“自杀质粒”）技术构建遗传重复和无效等位基因79

4.3 抑制82

4.2.4 把突变的染色体等位基因体内克隆到质粒载体上82

4.3.2.1 信息性抑制84

4.3.2 基因间抑制84

4.3.1 基因内抑制84

4.3.2.2 相互作用抑制基因85

4.4 基因互补86

4.3.2.5 生理性抑制86

4.3.2.3 剂量补偿性抑制86

4.3.2.4 旁路抑制基因86

4.4.1 基因内互补87

4.4.2.1 串联重复88

4.4.2 互补方法88

4.4.2.3 F＇附加体90

4.4.2.2 整合性质粒90

4.4.3 基因调控的互补分析91

4.4.2.4 特异性转导噬菌体91

4.5.2 无义极性93

4.5.1 Rho依赖性的转录终止93

4.5 极性93

4.5.3 插入极性95

4.5.4 极性的复杂性96

5.1 转座子在细菌遗传学中的应用98

第五章 转座子与融合98

5.1.1 转座子Tn10及衍生体99

5.1.1.1 ATS转座酶100

5.1.1.5 Tn10启动的缺失和重排101

5.1.1.4 调节转座酶的表达101

5.1.1.2 缺损型mini-Tn10转座子101

5.1.1.3 反式互补101

5.1.3 用于笔迹标识突变的转座子102

5.1.2 Tn5转座子102

5.2 Mu噬菌体103

5.2.1 Mud衍生体104

5.2.2 瞬间顺式互补作用105

5.2.3 作为克隆载体的Mud106

5.3 操纵子和基因融合107

5.2.4 在细菌遗传学中使用Mu的实践方面107

5.3.1 lac Z的操纵子和基因融合108

5.3.3 phoA的基因融合109

5.3.2 uidA（gus）的操纵子和基因融合109

5.3.4 体内表达技术111

6.1.1 何谓毒力基因？114

6.1 毒力基因的调节114

第六章 基因调控114

6.1.3 细菌是如何调节其毒力基因的？115

6.1.2 细菌为什么要对毒力基因进行调节？115

6.1.4 为什么要研究毒力基因的调节？116

6.2.3 DNA-蛋白质相互作用117

6.2.2 DNA结合位点117

6.2 攻击噬菌体：DNA-蛋白质相互作用的遗传分析117

6.2.1 DNA结合蛋白质117

6.2.4 P22调节机制118

6.2.6 攻击噬菌体的构建119

6.2.5 攻击噬菌体119

6.2.7 DNA结合蛋白的表达121

6.2.8.3 DNA结合蛋白突变体的选择123

6.2.8.2 DNA结合位点突变体的选择123

6.2.8 攻击噬菌体的使用123

6.2.8.1 体内DNA结合分析123

6.2.10.1 超感染排斥125

6.2.10 有关P22噬菌体的一些突变125

6.2.9 范例之一：Nac蛋白质125

6.2.10.2 arc（Am）突变126

6.2.10.4 噬菌斑127

6.2.10.3 基因9127

7.1.1 质粒接合的机制128

7.1 质粒与接合128

第七章 重组DNA128

7.1.2 染色体的诱动130

7.1.5 质粒接合的应用132

7.1.4 不相容性与遗传分析132

7.1.3 质粒诱动转移132

7.2.1 大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的转化133

7.2 转化和电转化133

7.2.3 电穿孔仪134

7.2.2 电转化134

7.3 分子生物学的基本技术135

7.3.1 小量质粒纯化（“微量制备技术”）136

7.3.3 酚抽提法137

7.3.2 大量纯化质粒DNA137

7.3.4 乙醇沉淀138

7.3.7 双脱氧法DNA序列分析139

7.3.6 DNA浓度推算139

7.3.5 从DNA标本中去除污染的小分子139

7.4.1 电流、电压和功率142

7.4 DNA电泳142

7.4.3 丙烯酰胺143

7.4.2 琼脂糖143

7.5.2 温度144

7.5.1 对称性PCR144

7.4.4 用溴化乙锭染色144

7.5 聚合酶链式反应144

7.5.4 引物146

7.5.3 DNA聚合酶146

7.5.8 循环数147

7.5.7 镁147

7.5.5 模板DNA147

7.5.6 dNTP147

7.5.10 PCR诱变148

7.5.9 不对称性PCR148

实验1～6简介154

实验篇154

第八章实验1 转座子：在结构基因中插入Mini-Mu-lac155

8.1.2 步骤156

8.1.1 材料156

8.1 构建Mudj的随机“跳跃”156

8.2.2 步骤158

8.2.1 材料158

8.2 将Mudj插入回交到野生型菌株158

8.4.1 材料159

8.4 使用srl::Mudj插入构建定点缺失159

8.3 利用Mud-P22作图确定srl：：Mudj的染色体图位159

8.3.1 材料159

8.3.2 步骤159

8.4.2 步骤160

8.5.2 步骤161

8.5.1 材料161

8.5 srl区域的缺失作图161

第九章 实验2 转座子：与结构基因连锁的Tn10d插入163

9.1.2 步骤164

9.1.1 材料164

9.1 构建Tn10d（Tc)的随机 跳跃”164

9.2.1 材料165

9.2 对srl邻近区域插入库的筛选165

9.2.2 步骤166

9.4.2 步骤168

9.4.1 材料168

9.3 证实Tn10d（Tc）插入与srl基因座的连锁168

9.3.1 材料168

9.3.2 步骤168

9.4 使用Mud-P22作图确定zgc::Tn10d（Tc）插入的图位168

9.5.2 步骤169

9.5.1 材料169

9.5 确定zgc::Tn10d[Tc]插入的相对图位:三点杂交169

第十章 实验3转座子:将Tn10d插入调节基因172

10.1.2 步骤173

10.1.1 材料173

10.1 构建Tn10d（Cm）的随机“跳跃”173

10.2.2 步骤174

10.2.1 材料174

10.2. 将Tn10d（Cm）插入回交到野生型菌株174

10.3.2 步骤175

10.3.1 材料175

10.3 检测reg::Tn10d（Cm）插入与srl操纵子的连锁175

10.5 构建srl串联重复菌株176

10.4.2 步骤176

10.4 使用Tn10d（Cm）插入测定非连锁的Regc的遗图位176

10.4.1 材料176

10.5.2 步骤177

10.5.1 材料177

10.6.2 步骤179

10.6.1 材料179

10.6 连锁的RegcTn10d（Cm）插入的互补分析179

第十一章 实验4 分离条件性突变体（热敏和琥珀突变）181

11.1.2 步骤182

11.1.1 材料182

11.1 分离DES（硫酸二乙酯）诱导的srl突变体182

11.2.1 材料183

11.2 定域诱变:分离羟胺诱导的srl突变体183

11.2.2 步骤184

11.3.1 材料185

11.3 温敏突变体的回交和鉴定185

11.3.2 步骤186

11.4.2 步骤187

11.4.1 材料187

11.4 琥珀抑制性突变体的回交和鉴定187

12.1.1 材料189

12.1 构建克隆文库189

第十二章 实验5 体内分子克隆189

12.1.2 步骤190

12.2.2 步骤191

12.2.1 材料191

12.2 分离质粒DNA和证实Srl+表现型191

12.3.2 步骤192

12.3.1 材料192

12.3 限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳192

12.4.1 材料193

12.4 亚克隆:限制性酶切化、连接和转化试验193

12.4.2 步骤194

13.1.2 材料197

13.1.1 菌株197

第十三章 实验6 使用脉冲场凝胶电泳进行细菌染色体的物理作图197

13.1.3 步骤198

实验7～11简介202

14.1.1 材料203

14.1 克隆了Nac结合位点（ Onαc）的质粒与噬菌体P22 mnt::Km9αrc（Am）的杂交203

第十四章 实验7 攻击噬菌体P22的构建203

14.1.2 步骤204

14.2.1 材料205

14.2 P22裂解物的PCR扩增和RFLP作图205

14.2.2 步骤206

14.3.1 材料208

14.3 P22 DNA的RFLP作图208

14.3.2 步骤209

14.4.2 步骤210

14.4.1 材料210

14.4 使用体内选择Kmr溶原菌方法鉴定Onαc攻击噬菌体210

15.3 步骤213

15.2 材料213

第十五章 实验8 攻击噬菌体的检测213

15.1 细菌菌株213

16.1.2 步骤217

16.1.1 材料217

第十六章 实验9 分离操纵子突变体217

16.1 mutD诱变217

16.2.2 步骤218

16.2.1 材料218

16.2 mutS诱变218

16.3.2 步骤219

16.3.1 材料219

16.3 羟胺（NH2OH）诱变219

16.4 选择突变的攻击噬菌体221

16.4.2 步骤222

16.4.1 材料222

17.1 攻击噬菌体的PCR扩增和循环测序224

第十七章 实验10 攻击噬菌体突变体的DNA序列分析224

17.1.2 噬菌体DNA预扩增226

17.1.1 材料226

17.2.1 材料227

17.2 使用32P标记的引物进行循环测序227

17.2.2 使用T4多聚核苷酸激酶进行引物末端标记228

17.2.4 非同位素DAN循环测序229

17.2.3 使用同位素标记的引物进行双脱氧链终止法序列测定229

17.3.1 材料230

17.3 DNA测序胶的制备230

17.3.2 步骤231

17.3.3 放射性自显影232

17.5 攻击噬菌体突变体的亚克隆和双链DNA序列分析233

17.4.1 阅读DNA测序胶233

17.4 银染方法233

17.5.1 材料234

17.5.2 将噬菌体DNA亚克隆到质粒载体上235

17.5.4 双链质粒DNA测序237

17.5.3 测序用质粒DNA的纯化237

18.1 细菌菌株239

第十八章 实验11 识别操纵子位点的第二位点抑制突变的分离239

18.3 步骤240

18.2 材料240

实验12～15简介246

19.1.1 材料247

19.1 将TnphoA转入霍乱弧菌247

第十九章 实验12 霍乱弧菌TnphoA插入体的分离247

19.1.2 步骤248

19.3.2 步骤249

19.3.1 材料249

19.2 利用质粒不相容性将载体 剔除 和表达phoA融合克隆子的分离249

19.2.1 材料249

19.2.2 步骤249

19.3 具有TCP表现型插入体的鉴定249

第二十章 实验13 用Southern DNA杂交对TnphoA插入作图251

20.1.2 步骤253

20.1.1 材料253

20.1 DNA提取253

20.3.1 材料254

20.3 DNA限制性酶切分析及电泳分析254

20.4.1 材料255

20.4 将DNA转移到膜上255

20.3.2 步骤255

20.4.2 步骤256

20.5 探针的制备257

20.5.1 材料257

20.5.2 步骤258

20.6 杂交259

20.6.1 材料259

20.6.2 步骤259

20.7 显影和显色259

20.7.1 材料259

20.7.2 步骤259

20.8 融合插入点相关位置的作图260

20.8.1 材料260

20.8.2 步骤260

第二十一章 实验14 使用自杀性质粒载体进行革兰氏阴性细菌的等位基因交换262

21.1.1 材料263

21.1 使用自杀性载体插入突变破坏taχR基因263

21.1.2 步骤264

21.2 使用表达核糖体蛋白S12的自杀性质粒将taxR点突变重组到染色体上265

21.2.1 材料265

21.2.2 步骤266

第二十二章 实验15 寡核苷酸指导的位点特异性诱变268

22.1.1 材料269

22.1.2 步骤269

22.1 单链DNA模板的分离269

22.2.1 材料271

22.2.2 步骤271

22.2 诱变寡核苷酸的磷酸化271

22.3.1 材料272

22.3.2 步骤272

22.3 诱变反应272

22.4.1 材料273

22.4.2 步骤273

22.4 制备mutS转化体库的质粒DNA,转化入ctx-lαcZ指示菌株273

22.5.1 材料274

22.5.2 步骤274

22.5 定点突变的回复突变274

附录278

第二十三章附录A 细菌菌株、噬菌体和质粒278

第二十四章 附录B 培养基及添加剂286

24.1 液体培养基286

24.2 固体培养基287

24.3 培养基添加剂289

24.4 抗生素290

24.5 缓冲液291

24.6 P22指示培养基291

24.7 MOPS培养基292

25.1 菌种保存294

25.2 菌种运输294

第二十五章 附录C 菌种收集294

25.3 菌种记录295

26.1.1 P22 HT裂解物的制备297

26.1 使用P22噬菌体进行普遍性转导297

26.1.2 转导试验（延迟性表达）297

第二十六章 附录D 基因的交换和作图297

26.2 用Mud-P22前噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌快速作图298

26.2.1 裂解物的制备298

26.1.3 转导试验（平板转导）298

26.2.2 噬菌体尾部的制备299

26.2.3 作图299

26.2.4 一些应该注意的问题301

26.3.1 P22裂解物的小量制备302

26.3.2 高滴度P22裂解物的制备302

26.3 P22噬菌体裂解物302

26.3.3 噬菌体滴度的滴定303

26.4 DEAE-纤维素匀浆304

26.5 羟胺诱变质粒DNA304

26.3.4 从高滴度裂解物中提纯噬菌体DNA304

26.5.1 缓冲液和溶液305

26.6 感受态细胞的制备和转化305

26.6.1 缓冲液和溶液306

26.7.2 小量制备电感受态细胞307

26.7.1 大量制备可冻存的电感受态细胞307

26.7.3 电穿孔307

26.7 电感受态细胞的制备和电转化307

第二十七章 附录E 酶活性的测定309

27.1 透化细胞的β半乳糖苷酶的活性测定309

27.1.1 缓冲液和溶液310

27.2 透化细胞的碱性磷酸酶活性测定310

27.2.1 缓冲液和溶液311

第二十八章 附录F 重组DNA方法313

28.1 质粒DNA的小量制备313

28.1.1 缓冲液和溶液314

28.2 限制性内切酶缓冲液315

28.3 乙醇沉淀315

28.4 酚抽提法316

28.4.1 TE饱和酚316

28.5.1 Sephadex G-50离心柱317

28.6 点滴透析317

28.5 离心柱317

28.7 琼脂糖凝胶电泳318

28.7.1 缓冲液和溶液318

28.8 非交性聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳319

28.8.1 缓冲液和溶液320

28.9.2 фx174HαeⅢ(lμg/μ）321

28.9.1 λHindⅢ（0.2μg/μl）321

28.10 PCR产物的纯化和定量321

28.9 常用的DNA分子量标准321

28.10.1 用有机溶剂抽提纯化PCR产物322

28.10.2 用MC滤器纯化丙烯酰胺凝胶的PCR产物322

28.10.3 用Qiagen？亲和柱纯化PCR产物323

28.10.4 用WizardTM制备物纯化PCR片段323

28.10.5 PCR产物DNA浓度的测定324

28.11 有 QIAquickTM凝胶抽提法纯化琼脂糖凝胶中的DNA条带324

28.12 Southern杂交溶液325

28.13 Southern溶液:GeniusTM系统327

28.14 使用Souhtern和Western分析对融合体的结合点作图328

28.15 寡核苷酸介导的位点特异性诱变329

28.15.1 缓冲液和溶液331

第二十九章 附录G 质粒和转座子限制性内切酶切图谱332

29.1 质粒pALTER-1333

29.2 质粒PEG5005333

29.3 质粒PSU18和pSU19334

29.4 质粒PgP704335

29.5 质粒pkAS32和pkAS46336

29.6 质粒ppy190337

29.7 质粒pPC36337

29.8 质粒PMS421338

29.9 质粒pGW1700338

29.10 Mu噬菌体衍生物339

29.11 转座子Tn10衍生物340

29.12 转座子TnphoA341

参考文献342

索引372