《核酸研究技术 下》求取 ⇩

目录1

第一部分 分子克隆1

第一章 大肠杆菌的基本知识和技术1

第一节 大肠杆菌的特征及其细胞结构1

一、大肠杆菌的分类特征1

二、大肠杆菌的细胞结构2

第二节 大肠杆菌基因的命名规则3

一、与代谢有关的结构基因3

三、与药物或噬菌体抗性有关的基因3

二、与代谢无直接关系的结构基因4

四、抑制基因4

五、染色体结构突变5

六、其他6

第三节 大肠杆菌的遗传性和变异性6

一、大肠杆菌的变异性6

二、大肠杆菌的菌株及其特性的鉴定8

三、大肠杆菌菌株的保存方法10

第四节 大肠杆菌的营养和生长11

一、大肠杆菌的营养11

二、大肠杆菌在固体培养基上的生长12

三、大肠杆菌在液体培养基中的生长13

第二章 基因工程的载体体系16

第一节 质粒载体16

一、细菌质粒的基本概念16

二、基因工程中质粒载体的选择20

三、介绍几类质粒载体23

第二节 λ噬菌体载体28

一、λ噬菌体的生物学特性28

二、λ噬菌体载体的构建33

三、常用的λ载体种类37

四、λ载体的选择和应用43

第三章 基因工程中常用的核酸酶类47

第一节 DNA和RNA连接酶47

一、T4DNA连接酶48

二、大肠杆菌DNA连接酶50

一、大肠杆菌聚合酶Ⅰ51

第二节 DNA聚合酶51

三、T4RNA连接酶51

二、DNA聚合酶的Klenow片段53

三、T4DNA聚合酶54

四、逆转录酶56

五、末端转移酶58

第三节 磷酸激酶和磷酸酶60

一、T4多核苷酸激酶60

二、碱性磷酸酶63

第四节 核酸水解酶65

一、外切酶Ⅲ66

二、S1核酸酶67

三、绿豆核酸内切酶68

五、λ外切酶69

四、外切酶Ⅶ69

六、Bal31核酸酶70

七、核糖核酸酶H72

第五节 甲基化酶73

一、原核细胞中的甲基化酶73

二、存在于大肠杆菌K12株中的甲基化酶74

三、甲基化酶的用法75

四、甲基化酶的实际应用76

第四章 分子克隆技术（一）81

——基因与载体的剪切及重组81

第一节 重组技术概述81

一、剪切获取特定的基因片段81

第二节 基因剪切常用方法82

一、基因剪切的特点82

二、载体的选择82

四、基因与载体的重组82

三、载体的剪切82

二、应用限制性内切酶水解基因与载体形成粘末端83

三、形成带有平末端的基因88

四、从平末端改造成粘末端97

第三节 剪切后基因与载体的连接104

一、带有粘末端的DNA片段之间的连接105

二、平末端及3′突出末端的连接特点106

三、基因片段大小与连接的关系107

四、防止载体自身连接的脱末端磷酸基团108

六、同聚物加尾后的连接110

五、连接后限制性内切酶识别位点的恢复110

第五章 分子克隆技术（二）——重组DNA的转化、筛选和鉴定111

第一节 重组DNA对大肠杆菌的转化112

一、氯化钙法112

二、氯化钙-氯化铷法113

三、大肠杆菌X1776的转化114

四、重组DNA克隆的初步筛选116

第二节 重组DNA克隆的核酸杂交筛选方法117

一、菌落杂交117

二、重组噬菌体DNA的杂交筛选119

第三节 免疫化学筛选方法120

一、抗体的制备121

二、抗体的纯化121

四、溴化氰活化滤纸法122

三、抗体蛋白质的125Ⅰ标记122

五、固相筛选法124

第四节 重组质粒和λ噬菌体DNA的小量快速制备方法125

一、碱裂解法制备质粒DNA125

二、煮沸法制备质粒DNA126

三、从单菌落中制备质粒DNA127

四、平板裂解法制备λ噬菌体DNA127

五、液体培养基裂解法制备λ噬菌体DNA128

第五节 重组DNA的酶切分析和鉴定129

一、单酶解分析129

二、双酶解分析130

三、多次酶解和电泳分析130

四、部分降解酶切分析131

五、人工合成探针在鉴定中的应用132

第六节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western技术在克隆鉴定中的应用133

一、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳134

二、电泳转移136

三、抗体的放射性检测法137

第六章 基因文库139

第一节 引言139

一、基因的分离139

二、什么是基因文库140

三、基因文库构建的基本步骤141

一、染色体DNA的抽提143

第二节 供体DNA143

二、染色体DNA的切割145

第三节 载体DNA148

一、λ替代型载体的结构特点149

二、载体DNA的制备151

三、制备载体的两臂和去除中央片段152

第四节 重组连接、体外包装和感染方法154

一、重组连接154

二、重组噬菌体DNA的体外包装158

三、重组噬菌体的感染161

四、基因文库的构建规模165

五、基因文库的扩增和贮存166

二、基因文库的构建过程168

一、考斯质粒作载体的优缺点168

第五节 考斯质粒为载体的基因文库168

结语170

第七章 cDNA克隆172

第一节 cDNA克隆的一般方法和步骤173

一、cDNA克隆方法173

二、cDNA克隆的具体步骤174

第二节 特异cDNA的克隆179

一、插入到表达载体中的cDNA克隆的筛选179

二、选择杂交法筛选特异cDNA克隆179

三、cDNA克隆操作实例180

一、cDNA克隆所使用的酶制剂182

第三节 cDNA克隆应注意的问题182

二、作为cDNA合成模板的mRNA183

三、载体DNA185

四、器械的消毒处理185

第二部分 基因表达187

第八章 基因表达与几种表达体系187

第一节 基因表达的基本原理188

一、乳糖和色氨酸操纵子的特点及其转录翻译元件188

二、lac与trp操纵子的基因表达调节191

三、真核细胞中的基因表达与多级调控193

第二节 常用的基因表达质粒194

一、lac启动子的应用194

二、trp启动子与人工合成tac启动子的应用196

第三节 翻译框架与融合蛋白199

三、λ噬菌体中PL与PR两个启动子的应用199

一、基因表达与翻译框架200

二、融合蛋白200

第四节 几种基因表达体系的比较201

第九章 大肠杆菌体系中的基因表达202

第一节 真核基因与原核基因在结构和表达调控上的差异202

第二节 影响真核基因在大肠杆菌体系中表达的因素203

一、启动子203

二、基因剂量205

三、核糖体结合位点206

五、编码多肽密码子的组成情况207

四、基因产物的稳定性207

六、表达产物的构象208

七、表达产物的分子量大小208

八、原核增强序列208

第三节 真核基因在大肠杆菌中表达的方式209

一、融合基因-融合蛋白209

二、非融合基因-非融合蛋白210

三、融合基因-非融合蛋白211

第四节 真核基因在大肠杆菌体系中的表达设计211

一、lac启动子211

二、trp启动子216

三、tac启动子219

四、PL启动子220

六、IPP启动子225

五、β内酰胺酶启动子225

第十章 酵母体系中的基因表达232

第一节 酵母表达系统概述232

一、载体232

二、启动子及其他控制序列234

三、寄主酵母菌株236

第二节 酵母表达系统的构建236

一、酵母启动子的提取236

二、表达载体的构建239

三、外源基因的引入和表达质粒的构建243

第三节 酵母体系中的基因表达248

一、酵母菌的转化248

二、酵母质粒的检测250

第十一章 哺乳动物细胞受体系统中的基因表达255

第一节 哺乳动物细胞表达外源基因概述256

第二节 哺乳动物细胞表达外源基因的必需条件256

一、外源DNA或供体DNA258

二、载体259

三、重组质粒的改建260

四、受体细胞267

五、选择标记和选择培养基269

六、重组DNA转染细胞271

七、图示几种转化表达HBsAg的系统275

附录一、大肠杆菌的常用培养基279

附录二、大肠杆菌的常用菌株281

附录三、大肠杆菌遗传学中常见的基因型282

附图283