《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》求取 ⇩

第一章 总论1

第一节 有关的免疫学理论2

一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系2

(一)抗原2

(二)抗体2

(三)抗原与抗体的关系2

二、抗原的性质及种类2

(一)抗原的性质2

(二)抗原的种类3

三、抗体的性质和种类4

(一)抗体的一般性质4

(二)抗原性和分类特征4

(四)抗原与抗体的反应5

(三)抗体的种类5

四、抗体形成的机理6

(一)免疫反应的形成6

(二)影响抗体产生的因素6

五、补体系统7

第二节 免疫细胞化学的有关技术概述8

一、抗体的制备和配制8

(一)抗体的制备8

(二)抗体的配制8

二、组织材料的处理10

三、免疫染色10

五、免疫细胞化学结果的判断11

(二)阴性对照11

(一)阳性对照11

四、对照11

(一)阳性细胞的染色特征12

(二)染色失败的几种原因12

第三节 有关细胞和组织学技术12

一、细胞和组织12

(一)细胞标本的取材13

(二)组织标本的取材13

二、细胞和组织的固定14

(一)固定14

(二)固定剂14

(三)固定方法16

三、组织切片技术16

第一节 抗原的制备21

第二章 抗原与抗体的制备21

一、抗原的提取22

(一)材料的选择及预处理22

(二)细胞的粉碎22

(三)抗原的提取23

(四)抗原的分离与纯化25

(五)抗原的浓缩32

二、免疫原的制备34

(一)载体34

(二)偶联剂34

(三)制备过程35

(三)佐剂36

(二)免疫途径36

第二节 抗体的制备36

(一)用于免疫的动物36

一、抗血清的制备36

(四)免疫方法37

(五)抗血清的采集与保存37

(六)抗血清质量的评价37

(七)免疫失败的可能原因及应采取的措施39

二、单克隆抗体的制备39

(一)动物的选择与免疫40

(二)细胞融合41

(四)杂交瘤的克隆化43

(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测43

(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏44

(六)单克隆抗体的大量生产45

(七)单克隆抗体的鉴定45

第三节 抗体的提取与纯化46

一、盐析法46

二、冷酒精沉淀法47

三、DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白47

(一)操作步骤47

(二)注意事项48

(三)试剂器材49

(二)操作步骤49

(四)注意事项49

四、SPA-Sepharose CL-4B亲合层析纯化IgG及IgG亚类49

(一)原理49

五、高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体50

(一)原理50

(二)操作步骤50

(三)试剂和器材50

(四)注意事项50

第三章 免疫荧光细胞化学技术52

第一节 免疫荧光细胞化学的原理52

一、直接法53

二、间接法53

四、双重免疫荧光标记法54

五、对照试验54

三、补体法54

第二节 荧光抗体的制备55

一、荧光素55

(一)异硫氰酸荧光素(FITC)55

(二)四乙基罗达明(RB200)56

(三)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)56

二、荧光素标记抗体的方法56

(一)FITC标记抗体的方法56

(二)四乙基罗达明标记抗体方法58

(三)四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法58

(四)藻红蛋白标记抗体方法59

(五)PE-标记蛋白A方法59

(六)蓝色荧光素标记抗体方法59

(一)染色特异性和敏感性的测定60

(二)F／P比值的测定60

三、荧光抗体的质量控制60

四、荧光抗体的保存61

第三节 免疫荧光细胞化学染色方法61

一、标本制作61

二、荧光抗体染色方法61

(一)直接法61

(二)间接法61

(三)补体法62

一、荧光显微镜63

第四节 荧光显微镜检查法63

三、荧光抗原染色法63

(六)荧光抗体再染色法63

(五)双重染色法63

(四)膜抗原荧光抗体染色法63

(一)光源64

(二)滤色系统64

(三)反光镜66

(四)聚光镜66

(五)物镜66

(六)目镜66

(七)落射光装置66

三、使用荧光显微镜的注意事项67

(五)镜油67

(三)标本67

(四)封裱剂67

(一)载玻片67

二、荧光显微镜标本制作要求67

(二)盖玻片67

四、荧光图像的记录方法68

第五节 非特异性染色的消除方法68

一、非特异性染色的主要因素68

二、消除非特异性染色的方法68

(一)动物脏器粉末吸收法68

(二)透析法69

(三)葡聚糖凝胶G-50柱层析法69

(六)纯化抗原法70

(八)伊文氏蓝(Evans blue)衬染法70

(七)纯化抗体法--免疫吸收法70

(五)荧光抗体稀释法70

(四)DEAE纤维素柱层析法70

第四章 免疫酶细胞化学72

第一节 固定和切片72

一、固定72

二、切片73

第二节 染色方法74

一、酶标抗体法74

(一)酶的种类及特点74

(二)酶标抗体的制备75

(三)酶标抗体的纯化78

(四)染色原理及步骤78

二、非标记抗体酶法81

(一)酶桥法81

(二)PAP法82

第三节 结果分析86

一、对照实验87

二、假阳性及其处理87

三、抗体有关事项88

四、单克隆抗体89

五、增加染色强度方法90

第四节 ICC的几种特殊应用91

一、ICC在铺片中的应用91

二、ICC的双重染色法92

(一)切片93

(二)染色93

三、ICC在细胞功能研究中的应用94

四、ICC在原位杂交技术中的应用95

第五章 免疫金银及铁标记技术98

第一节 免疫金技术发展史98

第二节 溶胶的基本概念98

一、胶体金98

(一)离子分散体系98

(二)胶体分散体系98

(三)粗分散体系99

二、胶体金的一般性状99

(一)胶体金的颜色99

(二)胶体金的稳定性99

(三)溶胶的聚沉现象99

(二)试剂的配制要求100

(一)玻璃器皿的清洁100

第三节 胶体金的制备方法100

一、制备胶体金的准备100

二、制备胶体金的方法和步骤101

(一)白磷还原法101

(二)抗坏血酸还原法101

(三)柠檬酸三钠还原法102

(四)鞣酸-柠檬酸三钠还原法102

(五)乙醇超声波还原法103

(六)硼氢化钠还原法103

(七)放射性胶体金的制备方法103

第四节 胶体金的质量鉴定103

一、胶体金颗粒直径测定103

二、胶体金金颗粒均匀度测定103

一、待标记蛋白质的准备104

二、胶体金pH值的调整104

三、影响胶体金颗粒大小的因素104

第五节 胶体金标记物的制备104

三、待标记蛋白质最适稳定量的测定105

四、蛋白质的胶体金标记106

五、胶体金标记蛋白质的纯化107

(一)高速与超速离心法107

(二)凝胶过滤法108

六、免疫金探针的鉴定108

第六节 免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择109

一、固定剂的选择及固定时间109

二、切片的处理与粘附109

(二)蛋白A-金(PAG)放大法110

(一)免疫金法(IGS)110

第七节 光镜免疫金银细胞化学方法110

一、免疫金染色110

二、免疫金银法111

(一)石蜡切片的IGSS染色112

(二)冰冻切片的IGSS染色112

(三)半薄切片的IGSS染色113

三、彩色免疫金银法(CIGSS)113

四、免疫金及免疫金银技术的优点114

五、在IGSS染色中常见技术问题和对策115

(一)背景染色产生的原因115

(二)背景染色已发生应如何消除115

(一)缓冲液的配制116

(二)银显影液的配制116

(三)彩色显影背景过染的处理方法116

六、物理显影液及缓冲液的配制116

(三)柠檬酸缓冲液的配制117

(四)氢氧化钠(NaOH)无水乙醇饱和溶液的配制117

第八节 免疫胶体铁细胞化学117

一、胶体铁的制备方法117

二、抗体的标记和纯化118

三、胶体铁标记抗体的鉴定118

四、免疫胶体铁细胞化学染色118

五、方法的应用119

一、基本原理121

二、几种抗生物素-生物素染色法121

第一节 抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法121

第六章 亲合组织化学技术及免疫细胞化学技术的某些进展121

第二节 葡萄球菌蛋白A(SPA)124

一、SPA的性质124

二、SPA的应用125

三、SPA在免疫细胞化学染色中的应用126

第三节 凝集素127

一、凝集素的特征128

二、凝集素的应用128

三、凝集素在免疫细胞化学中的应用129

四、HRP标记凝集素及抗凝集素抗体的制备131

第四节 免疫细胞化学技术的某些新进展132

二、免疫染色135

一、组织固定与取材135

第一节 电子显微镜免疫细胞化学技术概述135

第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术135

二、包埋136

(一)树脂包埋136

(二)低温包埋136

四、对照试验140

第二节 免疫铁蛋白技术140

一、基本原理140

二、铁蛋白的提取和纯化140

三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合141

四、电镜标本的制备方法142

第三节 免疫酶细胞化学技术142

一、基本原理142

二、电镜标本的制备方法143

一、电镜水平的免疫金染色法144

第四节 免疫电镜胶体金标记法144

二、胶体金标记蛋白A技术146

三、胶体金双标记技术147

四、免疫电镜金-银法染色技术148

第五节 其它免疫电镜技术149

一、凝集素电镜标记技术149

二、扫描免疫电镜技术149

(一)标记物150

(二)免疫标记方法150

(三)扫描免疫电镜的具体操作步骤150

三、冷冻蚀刻免疫电镜技术152

(一)RIA的优点155

(二)RIA的缺点155

第一节 概述155

一、放射免疫分析的优缺点155

第八章 蛋白质与多肽激素的放射免疫分析155

二、基本原理156

第二节 放射性碘标记158

一、同位素的选择158

二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记159

(一)氯胺T法159

(二)乳过氧化物酶法162

(三)Iodogen碘化法163

(四)酰化试剂(Bloton和Hunter试剂)法163

(一)纯化标记化合物的常用方法164

(二)标记化合物的主要质量指标164

三、放射性标记化合物的纯化与鉴定164

第三节 结合和游离部分的分离169

一、对分离方法的要求169

二、常用的分离方法169

(一)吸附分离法170

(二)沉淀分离法170

(二)双抗体分离法170

(四)磁性分离法170

(五)固相包被分离法171

(六)双抗法？PEG的分离法171

第四节 样品的前处理171

一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取(以大鼠为例)171

四、血浆172

三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取(以胃粘膜为例)172

二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法(以下丘脑为例)172

五、脑脊液174

六、尿174

七、胃液174

第五节 放射免疫分析法的建立174

一、放射免疫分析的基本试剂174

(一)标准品174

(二)标记物175

(三)抗体175

(四)B与F分离剂175

(五)缓冲液175

二、加样程序175

(二)顺序饱和加样程序176

(一)平衡饱和加样程序176

(三)计数、绘制标准曲线与测定样品含量177

三、放射免疫分析的质量控制177

(一)质量控制的目的和内容177

(二)放射免疫分析中造成测量误差的因素178

(三)放射免疫分析中测量误差的控制178

第九章 免疫细胞化学与图像分析180

一、定量分析的重要性180

二、图像分析仪简介180

三、常用的测量方法182

(一)灰度182

(二)长度183

(三)面积183

四、图像分析仪工作程序183

五、没有图像分析仪可否进行图像分析185

六、实例介绍188

七、图像分析与体视学189

八、国内外生产图像分析仪的情况简介191

(一)国内情况191

(二)国外情况191

第十章 流式细胞术(FCM)在免疫细胞化学中的应用194

第一节 流式细胞术简介194

一、流式细胞术发展简史194

二、流式细胞计的基本结构和工作原理195

第二节 FCM在生物医学工程学方面的应用202

一、FCM应用的技术途径202

二、FCM的典型应用简介203

一、白细胞的免疫荧光标记技术207

第三节 FCM对外周血白细胞的免疫荧光分析207

二、白细胞免疫荧光分析的数据分析210

三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义214

第十一章 免疫细胞化学在神经科学中的应用222

一、确定神经递质的性质、定位和分布222

二、探查和发现新的神经递质223

三、追踪神经束的行径及其投射区223

四、区别神经细胞、神经胶质细胞和内分泌细胞224

五、研究神经递质的超微结构定位225

六、神经递质共存的研究227

七、个体和种族发育的研究228

八、与神经组织培养技术相结合进行神经生物科学的研究228

十、神经系统的机能研究229

九、应用于受体的研究229

第十二章 肿瘤免疫细胞化学231

第一节 神经肿瘤免疫细胞化学231

一、细胞骨架中的中间丝蛋白231

(一)神经细丝酸性蛋白231

(二)神经细丝232

二、神经特异性烯醇化酶232

三、S-100蛋白232

第二节 神经内分泌肿瘤免疫细胞化学233

一、垂体腺瘤234

(一)生长激素腺瘤234

(二)催乳激素腺瘤234

(七)无功能活性腺瘤235

(六)多种激素性腺瘤235

二、胰岛细胞瘤235

(三)促甲状腺激素腺瘤235

(四)促肾上腺皮质激素腺瘤235

(五)促性腺激素腺瘤235

三、甲状腺髓样癌236

四、肺支气管类癌及肺小细胞癌236

五、食管燕麦细胞癌236

六、皮肤神经内分泌癌(Merker细胞瘤)236

第三节 软组织与骨肿瘤免疫细胞化学237

一、常用标记抗体237

(二)肌源性肿瘤的免疫细胞化学标记238

(三)血管源肿瘤免疫细胞化学标记238

(一)纤维组织与纤维组织细胞性肿瘤免疫细胞化学标记238

二、软组织肿瘤免疫组织化学238

(四)双向分化的软组织肿瘤免疫细胞化学标记239

(五)脂肪源肿瘤免疫细胞化学标记239

(六)外周神经肿瘤免疫细胞化学标记240

(七)组织发生未定的软组织肿瘤240

三、骨及软骨肿瘤免疫细胞化学标记240

第四节 免疫活性细胞及其肿瘤的免疫细胞化学241

一、免疫活性细胞的免疫细胞化学241

(一)B淋巴细胞241

(二)T淋巴细胞242

(三)NK细胞／K细胞243

(二)恶性淋巴瘤与非淋巴网状组织肿瘤的鉴别244

(一)恶性淋巴瘤与淋巴网状组织反应性增生的鉴别诊断244

(四)单核／巨噬细胞与网状细胞244

二、恶性淋巴瘤的免疫细胞化学标记244

(三)恶性淋巴瘤的免疫功能分型245

(四)在恶性淋巴瘤免疫表型分析中的注意事项245

第五节 上皮组织肿瘤免疫细胞化学246

一、角蛋白247

(一)角蛋白抗体及其在肿瘤病理学中的应用247

(二)有关方法学的应注意的问题249

二、器官特异性及其它肿瘤标记物250

(一)上皮膜抗原251

(二)桥粒蛋白251

(三)癌胚抗原251

(七)CA125252

(八)神经元特异性烯醇化酶252

(四)甲胎蛋白252

(六)CA19-9及CA50252

(五)前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酯酶252

(九)甲状腺球蛋白和降钙素253

(十)血型抗原253

第十三章 消化器官免疫细胞化学256

第一节 胃肠道粘膜免疫细胞化学特点256

一、抗原的稳定性256

二、抗体的特异性257

三、染色技术的选择性257

第二节 胃肠道粘膜抗体产生细胞258

一、抗体产生细胞的特点258

四、结果的可比性258

二、双标记免疫荧光染色259

三、临床意义260

第三节 消化道分泌性IgA262

一、SIgA的合成及其功能262

二、对比免疫荧光染色262

三、临床意义263

第四节 胃肠道粘膜T淋巴细胞264

一、T淋巴细胞分布及其特点264

二、研究方法265

三、临床意义266

一、癌胚抗原的特点267

第五节 癌胚抗原的免疫细胞化学267

二、癌胚抗原免疫细胞化学染色268

三、临床意义269

第六节 胃肠道溶菌酶269

一、溶菌酶在胃肠道的分布269

二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点269

三、溶菌酶研究的临床意义270

第七节 消化管壁内神经丛的免疫细胞化学271

一、内源性神经的结构271

(一)神经丛的模式272

(二)神经元的数目和大小272

(三)神经细胞的类型272

一、乙型肝炎免疫细胞化学273

第八节 肝脏疾病免疫细胞化学273

二、消化道全层铺片技术273

(一)乙型肝炎的免疫反应发病机理274

(二)乙型肝炎与自身免疫反应275

(三)乙型肝炎肝细胞内病毒抗原的定位及分布276

二、肝硬变免疫细胞化学277

(一)肝硬变组织内HBV抗原的定位及分布277

(二)肝硬变组织内纤维结合蛋白(FN)的定位及分布278

(三)肝硬变组织内Ⅲ型胶原的定位及分布278

(四)肝硬变组织内角蛋白定位及分布278

三、肝癌免疫细胞化学279

(一)HBV与原发性肝癌的流行病学证据279

(三)肝细胞肝癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布280

(二)肝硬变与肝癌的关系280

(四)肝内胆管细胞癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布282

(五)肝细胞癌中的HBV的分子生物学282

(六)肝癌发生中HBV分子遗传学及免疫机理283

第十四章 肾脏疾病免疫细胞化学286

第一节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中的应用范围286

一、肾脏组织的检查286

(一)免疫荧光细胞化学技术的应用286

(二)免疫酶标细胞化学技术的应用288

(三)电镜免疫细胞化学技术的应用289

二、血清或肾脏洗脱液的检查289

三、尿液的检查290

四、肾小球细胞的体外培养290

二、肾小球系膜区291

一、肾小球毛细血管壁291

第二节 荧光或酶标抗体在肾脏内显示的部位及形式291

三、肾小球毛细血管壁及系膜区292

四、新月体内292

五、肾小球球囊腔292

六、肾小管292

七、小动脉292

八、肾间质292

第三节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中应用的意义292

一、免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中应用的意义292

(一)肾小球疾病发病机制的研究292

(二)判断肾脏疾病是否为免疫性疾病293

(四)其它294

(三)有助于某些肾小球疾病的确诊294

二、免疫电镜技术在肾脏疾病中应用的意义295

第四节 各种肾脏疾病的病变以及免疫荧光(酶标)表现特征296

一、原发性肾小球疾病296

二、继发于全身性疾患的肾小球疾病297

三、结缔组织病时的肾脏损害298

四、血管性疾患导致肾脏的损害298

五、代谢性疾患引起的肾脏损害298

六、某些特殊疾病时的肾脏损害299

七、遗传性和先天性肾病299

八、杂病299

九、肾移植300

十、肾小管间质性疾病300

第十五章 自身抗体的免疫组织化学检测方法和应用302

第一节 自身抗体的免疫组织化学检测方法303

一、抗核抗体的检测305

第二节 在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用305

二、双链DNA抗体的检测方法和应用308

三、抗核仁抗体的检测法309

四、抗组蛋白抗体的检测方法309

五、抗着丝点抗体的检测方法309

六、抗甲状腺自身抗体的检测方法310

七、平滑肌抗体的检测311

八、肝细胞膜抗体的检测312

九、线粒体抗体313

十、胃壁细胞抗体的检测314

十一、胃泌素细胞抗体的检测314

十四、抗皮肤成分自身抗体的检测315

十二、胰岛细胞抗体的检测315

十三、抗肾小球和肺泡基底膜抗体的检测315

十五、唾液腺外分泌导管上皮自身抗体的检测316

十六、抗横纹肌自身抗体的检测316

十七、肾上腺自身抗体的检测317

十八、类风湿因子的检测317

十九、抗中性白细胞胞浆自身抗体318

二十、增殖细胞核抗原抗体318

二十一、抗类风湿关节炎相关核抗原的抗体319

二十二、抗精子抗体319

二十三、其他自身抗体的检测319

三、独特型-抗独特型网络缺陷学说320

二、T细胞旁路学说320

一、自身淋巴细胞免疫调控反应紊乱学说320

第三节 自身抗体产生的机理320

四、遗传因素321

第十六章 病原体的免疫细胞化学快速检查方法和应用323

第一节 在细菌学中的应用323

一、甲组溶血性链球菌的快速检查法325

(一)试剂制备325

(二)检查方法325

三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法326

六、致病性大肠杆菌的快速检查法326

四、鼠疫杆菌的快速检查法326

五、炭疽杆菌的快速检查法326

(二)检查方法326

(一)制备荧光抗体326

二、脑膜炎双球菌的快速检查法326

七、结核杆菌的快速诊断方法327

八、其他细菌的快速检查方法327

九、钩端螺旋体的检查法327

十、梅毒螺旋体的检查法327

(一)抗原制备327

(二)荧光抗体328

(三)间接免疫荧光染色方法(FTA试验)328

(四)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验328

(五)梅毒螺旋体的直接检查法328

第二节 在病毒学中的应用328

一、病毒抗原定位328

五、病毒的快速诊断329

四、病毒计数329

二、病毒感染过程329

三、肿瘤与病毒329

(一)病毒的检查330

(二)抗体的检查331

(三)常见病毒的快速检查方法331

第三节 在寄生虫学中的应用332

一、血吸虫病332

(一)抗原332

(二)待检血清332

(三)荧光抗体332

(四)检查方法332

二、疟疾332

六、弓形虫病333

七、旋毛虫病333

三、阿米巴病333

五、丝虫病333

四、锥虫病333

八、其他寄生虫病334

第四节 在真菌学中的应用334

第十七章 免疫细胞化学在皮肤病学的应用335

第一节 角阮细胞335

一、对角质层抗原与角质层自身抗体、角蛋白抗原的研究335

二、对天疱疮的研究335

三、HLA-DR抗原336

五、其它337

四、凝集素受体337

第二节 黑素细胞及其肿瘤338

一、正常黑素细胞338

二、色素痣338

三、恶性黑素瘤338

第三节 Merkel细胞339

一、免疫细胞化学在Merkel细胞起源和功能认识中的作用339

二、Merkel细胞癌的免疫细胞化学诊断340

第四节 郎格罕细胞340

一、研究LC自身的表面标记341

二、研究皮肤病中LC数量、密度及结构的改变341

(一)基底膜带的结构342

(二)病变部位于基底膜带的几种大疱性皮肤病342

一、基底膜带342

第五节 真皮与表皮交界342

二、狼疮带试验344

第六节 免疫细胞化学技术在真皮纤维化性疾病研究中的应用345

一、确定细胞外基质成分在真皮中的分布345

二、研究纤维化皮损中细胞的表型特征和(或)功能状态345

(一)成纤维细胞345

(二)肌纤维母细胞(Myofibroblast)346

(三)单一核浸润细胞346

(四)内皮细胞和肥大细胞346

三、检测与纤维化发生有关的细胞因子346

二、B淋巴细胞和免疫球蛋白的表达347

一、T淋巴细胞及其亚群的免疫表达347

第七节 真皮浸润细胞免疫表达347

四、其它347

三、其它348

第八节 汗腺及腺肿瘤的免疫细胞化学特点348

第十八章 核酸分子杂交技术概述354

第一节 核酸的分子结构354

一、核酸的化学组成354

二、核酸的一级结构355

三、核酸的高级结构356

(一)DNA356

(二)RNA357

四、基因组织357

一、DNA变性359

第二节 DNA的变性与复性359

二、复性360

第三节 分子杂交362

一、概述362

二、探针-鞍反应363

三、核酸探针的种类364

(一)DNA探针364

(二)cDNA探针365

(三)RNA探针365

(四)寡核苷酸探针366

四、核酸探针的标记和检测367

(一)核酸探针的常用酶促标记技术368

(二)核酸探针的非放射性标记技术369

(三)非放射性探针的显示体系370

(一)固相膜核酸分子杂交方法372

五、核酸分子杂交的类型372

(二)固相核酸分子杂交类型374

(三)固相膜核酸杂交的几点说明378

(四)液相核酸分子杂交类型378

六、核酸分子杂交实验因素的优化379

(一)探针的选择379

(二)探针的标记方法380

(三)探针的浓度380

(四)杂交率380

(五)杂交最适温度381

(六)杂交的严格性382

(八)杂交促进剂383

(七)杂交反应时间383

第四节 石蜡包埋组织的DNA提取及其应用384

一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法384

二、影响DNA提取质量的因素386

三、提高DNA提取质量的方法387

四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学388

五、分子病理学研究中的应用389

第十九章 核酸(基因)分子探针394

第一节 概述394

第二节 核酸(基因)探针目的核酸的制备技术395

一、特异性目的核酸(或基因)的制备395

一、缺口平移法396

二、末端标记法396

二、目的核酸的扩增396

第三节 放射性同位素标记核酸探针396

三、应用特异单引物法标记DNA探针397

四、双引物法标记DNA探针法398

五、聚合酶链反应(PCR)标记高活性DNA探针398

第四节 非放射性标记核酸探针398

一、生物素标记核酸探针方法399

二、光敏生物素标记核酸探针399

三、生物素-补骨脂素(Biorin-psoralen)标记法400

四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法400

五、缺口平移法标记生物素DNA探针(二步法)400

六、生物素随机引物标记探针方法401

七、异羟基洋地黄甙Digoxigenin标记核酸探针401

十、生物素化的RNA探针标记402

十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法402

八、光敏2，4-二硝基苯(光敏DNP)标记DNA法402

九、三硝基苯磺酸(TNBS)标记核酸探针402

十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针403

第五节 寡核苷酸探针的制备403

第二十章 原位杂交组织化学406

第一节 原位杂交组织化学概述406

一、核酸杂交技术406

二、原位杂交组织化学技术的由来及发展406

三、原位杂交组织化学技术的基本方法408

(一)固定408

(二)玻片和组织切片的处理409

(三)杂交(Hybridisation)410

(六)对照试验和ISHH结果的判断413

(五)显示(Visualization)413

(四)杂交后处理(Post hybridisation treatment)413

第二节 cRNA探针在原位杂交组织化学(ISHH)中的应用414

一、同位素标记cRNA探针在ISHH中的应用415

(一)组织切片的原位杂交细胞化学方法415

(二)培养细胞的原位杂交细胞化学方法417

二、生物素cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用417

(一)光敏生物素标记cRNA探针的应用417

(二)酶促生物素标记cRNA探针的应用418

三、地高辛标记cRNA探针的应用418

(一)基本原理418

(二)基本操作步骤419

一、DNA探针的应用421

(一)地高辛-碱性磷酸酶(Dig-AKP)标记DNA探针在石蜡包埋切片检测病毒DNA中的应用421

第三节 DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学中的应用421

(二)荧光标记DNA探针的应用422

二、寡核苷酸探针的应用426

(一)地高辛标记寡核苷酸探针的应用426

(二)同位素标记寡核苷酸探针的应用427

第四节 原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法427

一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序428

二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法429

第五节 原位杂交免疫细胞化学技术的未来与展望430

一、PCR与原位杂交细胞化学结合法431

二、快速原位杂交细胞化学技术432

三、原位启动标记法432

(一)染色体的形态结构435

一、有关染色体的基本知识及制片435

第一节 原位杂交技术在染色体铺片的应用435

第二十一章 原位杂交技术在染色体和电镜水平的应用435

(二)染色体G显带技术438

(三)高分辨染色体G带技术438

(四)外周血培养及染色体制片技术439

二、应用ISHH技术对染色体制片、基因分配(Chromosomal assignment of genes)的研究441

(一)基本原理441

(二)操作步骤(Bhatt and McGee,1990)442

三、利用ISHH技术对肿瘤或癌前组织的细胞间期染色体铺片进行研究443

(一)基本原理443

(二)基本操作方法443

(一)基本原理445

(二)基本操作方法445

四、利用性染色体特异性DNA探针的ISHH技术445

第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用447

一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片(Hutchison et al 1982)447

二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术448

(一)基本原理448

(二)应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术(Binder et al 1986)448

三、应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术450

(一)基本原理450

(二)基本操作方法(FischerD,et al 1992)450

四、结语452

第二十二章 聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用454

第一节 概述454

第二节 PCR技术的原理454

一、PCR操作范例455

第三节 PCR操作范例及反应体系的组成455

二、PCR反应系统的组成456

(一)PCR缓冲液(PCR Buffer)456

(二)四种脱氧三磷酸核苷酸(4×dNTPs)457

(三)引物的量457

(四)TaqDNA聚合酶的量457

(五)模板458

(六)石蜡油458

三、电泳分析458

第四节 影响PCR的主要因素459

一、温度循环参数459

二、引物与引物设计460

三、DNA聚合酶461

四、影响PCR特异性的因素463

五、扩增平坡464

第五节 PCR各种应用模式464

一、兼并引物(Degenerate primer)PCR465

二、套式引物(Nested primer)PCR465

三、复合PCR(Multiplex PCR)466

四、反向PCR(Inverse PCR或Reverse PCR)466

五、不对称PCR(Asymmetric PCR)466

六、标记PCR(LP-PCR)和彩色PCR466

七、加端PCR467

八、锚定PCR或固定PCR467

九、玻片PCR467

十、反转录PCR方法检测RNA468

一、样品处理469

十一、定量PCR469

第六节 样品处理与注意事项469

二、注意事项471

第七节 PCR仪器的发展472

第八节 PCR临床应用领域及特点473

一、PCR应用特点473

二、PCR应用领域473

第九节 其它链扩增技术及应用范围474

一、免疫PCR474

二、转录依赖的扩增系统(Transcription-based amplification system,TAS)475

三、再生式序列复制技术(3SR)475

四、连接酶链式反应(Ligase chain reaction,LCR)476

五、PCR-SSCR分析技术476

六、结语477

第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用479

第一节 工具酶479

一、DNA限制性内切酶479

(一)命名原则479

(二)分类和特性480

二、甲基化酶481

二、分子克隆化的另一些酶483

(一)DNA聚合酶483

(二)RNA聚合酶483

(三)反转录酶484

(四)核酸外切酶484

(十)碱性磷酸酯酶485

(九)末端转移酶485

第二节 分子克隆载体485

(六)DNA酶485

(七)RNA酶485

(五)核酸酶S1485

(八)连接酶485

一、质粒486

(一)大肠杆菌质粒486

(二)真核生物中的质粒487

二、噬菌体和病毒载体487

(一)噬菌体λ载体的构建488

(二)单链噬菌体载体488

(四)逆转录病毒489

三、柯斯质粒489

(三)猴病毒40(SV40)489

四、其他载体490

(一)转座子载体490

(二)人工微小染色体491

第三节 DNA重组实验中常用的技术492

一、质粒DNA的提取及鉴定492

(一)质粒DNA的小量制备492

(二)质粒DNA的大量制备492

(三)质粒DNA的鉴定493

二、DNA的重组493

(一)DNA的酶切与连接493

(二)大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化493

(四)转化子DNA的酶切鉴定494

(五)重组子DNA的进一步鉴定494

(三)转化子DNA的快速鉴定--快速细胞破碎法494

三、地高辛配基随机标记DNA探针法495

(一)概述495

(二)试剂盒成份495

(三)需配制的溶液496

(四)操作方法496

(五)排除实验中问题的方法498

四、核酸的分子杂交498

(一)斑点杂交的直接点样法498

(二)DNA的吸印转移法(Southern blot)499

(一)白细胞DNA的制备500

五、真核酸细胞基因组DNA的制备500

(四)硝酸纤维膜固相杂交500

(三)RNA的吸印转移法(Northern bolt)500

(二)组织DNA的制备501

六、转移基因502

第四节 遗传病与肿瘤的基因诊断504

一、分离基因进行结构分析504

二、DNA限制性片段多态性连锁分析504

三、聚合酶链反应507

第五节 “DNA指纹”与法医鉴定508

附录一 免疫细胞化学常用试剂介绍510

附录二 原位杂交组织化学常用试剂及处理526

附录三 全血细胞培养染色体技术常用试剂配制541

附录四 实验室常用技术参数资料544

本书常用缩写词571