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第一章 基因与基因工程1

第一节 基因研究的发展1

1.基因学说的创立1

2.基因与DNA分子3

3.基因与DNA的多核苷酸区段5

4.基因与多肽链6

5.基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序7

6.基因的结构10

7.基因的表达与调控12

8.基因的分离14

9.基因的合成16

第二节 基因的现代概念17

1.移动基因17

（1）插入序列18

（2）转位子20

（3）转位作用21

（4）逆转位子22

2.断裂基因22

（1）断裂基因的发现23

（2）间隔子位置的测定23

（3）间隔子及表达子的一般特点24

（4）mRNA初级转录本的剪辑25

3.假基因28

（1）重复的假基因28

（2）加工的假基因29

4.重复序列及重复基因30

（1）唯一序列及低度重复序列31

（2）中度重复序列32

（3）高度重复序列33

5.重叠基因34

第三节 基因工程的诞生及其主要的研究内容37

1.基因工程的诞生37

2.基因工程的定义及其主要的研究内容43

3.有关基因工程安全性的争论44

4.重组DNA技术的应用与发展47

第二章 基因操作的主要技术原理51

第一节 核酸的凝胶电泳51

1.基本原理51

2.琼脂糖凝胶电泳52

3.脉冲电场凝胶电泳54

第二节 核酸分子杂交55

1.萨瑟恩DNA印迹杂交56

2.诺塞恩RNA印迹杂交59

3.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交59

4.菌落（或噬菌斑）杂交60

第三节 细菌转化61

1.肺炎链球菌的转化61

2.大肠杆菌的转化62

3.细菌转化频率62

第四节 DNA核苷酸序列分析64

1.Sanger 双脱氧链终止法65

（1）Sanger双脱氧链终止DNA测序法的原理65

（2） Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法67

（3） Sanger双脱氧-pUC体系DNA序列分析法69

2.Maxam-Gilbert化学修饰法71

（1）Maxam-Gilbert化学修饰法的原理71

（2）碱基特异的化学切割反应71

（3）Maxam-Gilbert化学修饰-CS载体系统DNA序列分析法75

（4）Maxam-Gilbert化学修饰法的优点76

3.DNA序列分析的自动化76

4.DNA杂交测序78

（1）DNA杂交测序原理78

（2）固定DNA或寡核苷酸的矩阵芯片79

（3）杂交的检测80

（4）SBH的应用81

第五节 基因的化学合成82

1.基因化学合成的概况82

2.磷酸二酯法合成寡核苷酸82

3.磷酸三酯法合成寡核苷酸83

4.固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸85

5.用寡核苷酸片段组装基因的方式85

6.寡核苷酸化学合成的实际用途87

（1）作为合成基因的元件87

（2）作为核苷酸序列分析的引物88

（3）作为核酸分子杂交的探针88

（4）用于基因定点诱变研究88

（5）作为PCR扩增反应的引物89

（6）作为重组DNA连接构件89

第六节 基因定点诱变89

1.盒式诱变89

2.寡核苷酸引物诱变92

（1）寡核苷酸引物诱变原理92

（2）寡核甘酸引物诱变过程93

（3）寡核苷酸引物诱变法的局限性95

（4）提高寡核苷酸引物突变效率的办法95

3.PCR诱变97

（1）重组PCR定点诱变法97

（2）大引物诱变法99

第七节 基因扩增99

1.PCR技术的基本原理及特点100

2.Taq DNA聚合酶103

3.寡核苷酸引物105

（1）引物的长度105

（2）简并引物106

（3）嵌套引物107

4.PCR技术的研究应用107

（1）基因组克隆107

（2）反向PCR与染色体步移107

（3）不对称PCR与DNA序列测定108

（4）RT-PCR与RNA分析110

（5）基因的体外诱变与突变的检测112

（6）基因组的比较研究112

第八节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法113

1.凝胶阻滞试验114

2.DNasel足迹试验114

3.甲基化干扰试验117

4.体内足迹试验119

第三章 基因克隆的酶学基础121

第一节 核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割122

1.寄主控制的限制与修饰现象122

2.核酸内切限制酶的类型124

3.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的基本特性128

4.Ⅱ型核酸内切限制酶的基本特性129

（1）基本特性129

（2）同裂酶130

（3）同尾酶131

（4）限制片段末端的连接作用131

5.核酸内切限制酶的命名法133

6.影响核酸内切限制酶活性的因素134

（1）DNA的纯度134

（2）DNA的甲基化程度134

（3）酶切消化反应的温度135

（4）DNA的分子结构135

（5）核酸内切限制酶的缓冲液136

7.核酸内切限制酶对DNA的消化作用136

（1）核酸内切限制酶与靶DNA识别序列的结合模式136

（2）核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化问题136

（3）核酸内切限制酶对真核基因组DNA的消化作用137

第二节 DNA连接酶与DNA分子的体外连接137

1.DNA连接酶138

2.粘性末端DNA片段的连接140

3.平末端DNA片段的连接141

（1）同聚物加尾法141

（2）衔接物连接法144

（3）DNA接头连接法146

4.热稳定的DNA连接酶150

（1）寡核苷酸连接测定法150

（2）边接酶链式反应（LCR）150

第三节 DNA聚合酶153

1.DNA聚合酶Ⅰ与核酸杂文探针的制备153

（1）DNA聚合酶Ⅰ153

（2）DNA缺口转移156

（3）DNA杂交探针的制备157

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段与DNA末端标记158

3.T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段160

4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成161

5.T7DNA聚合酶163

6.修饰的T7DNA聚合酶163

第四节 DNA及RNA的修饰酶164

1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾164

2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5 -末端的标记165

3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用167

第五节 核酸外切酶169

1.核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）169

2.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）169

3.λ核酸外切酶（λexo）和T7基因6核酸外切酶171

第六节 单链核酸内切酶171

1.S1核酸酶与RNA分子定位171

2.Bal31核酸酶与限制位点的确定173

第四章 基因克隆的质粒载体176

第一节 质粒的一般生物学特性176

1.质粒DNA176

2.质粒DNA编码的表型178

3.质粒DNA的转移180

（1）质粒的类型180

（2）F质粒180

（3）质粒DNA的接合转移181

4.质粒DNA的迁移作用183

5.质粒DNA的复制类型185

6.质粒的不亲和性186

（1）质粒的不亲和性现象186

（2）质粒不亲和性的分子基础187

第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制189

1.质粒DNA复制的多样性189

2.ColE1质粒DNA复制的启动190

3.质粒DNA拷贝数的控制190

（1）天然质粒拷贝数的控制190

（2）杂种质粒拷贝数的控制191

4.质粒复制控制的分子模型191

（1）抑制蛋白质稀释模型191

（2）自体阻遏蛋白质模型193

第三节 质粒DNA的分离与纯化194

1.氯化铯密度梯度离心法195

2.碱变性法196

3.微量碱变性法196

4.影响质粒DNA产量的因素198

（1）寄主菌株的遗传背景198

（2）质粒的拷贝数及分子大小199

第四节 质粒载体的构建及类型199

1.天然质粒用作克隆载体的局限性199

2.质粒载体必须具备的基本条件200

3.质粒载体的选择记号202

4.不同类型的质粒载体203

（1）高拷贝数的质粒载本203

（2）低拷贝数的质粒载体204

（3）失控的质粒载体204

（4）插入失活型的质粒载体205

（5）正选择的质粒载体205

（6）表达型的质粒载体207

第五节 重要的大肠杆菌质粒载体208

1.pSC101质粒载本208

（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例一——葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达209

（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例二——在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA211

2.ColE1质粒载体211

3.pBR322质粒载体214

（1）pBR322质粒载体的构建214

（2）pBR322质粒载体的优点216

（3） pBR322质粒载体的改良219

（4）应用pBR322质粒作为基因克隆载体的实例——水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析220

4.pUC质粒载体221

（1） pUC质粒载体的结构221

（2） pUC质粒载体的优点223

5.其它重要的质粒载体224

（1）丧失迁移功能的质粒载体224

（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体225

（3）穿梭质粒载体227

第六节 质粒载体的稳定性问题229

1.质粒载体不稳定性的类型229

（1）结构的不稳定性229

（2）分离的不稳定性230

2.影响质粒载体稳定性的主要因素230

（1）新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应230

（2）拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响232

（3）寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应232

3.随机分配的分子机理233

（1）通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平234

（2）通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体234

（3）通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生234

（4）大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性234

4.主动分配的分子机理235

（1）分配区的结构与功能235

（2）预配对模型236

（3）二聚体的解离有助于质粒的主动分配237

（4）寄主致死功能对质粒稳定性的效应238

第五章 噬菌体载体和柯斯载体240

第一节 噬菌体的一般生物学特性240

1.噬菌体的结构及其核酸类型240

2.噬菌体的感染性240

3.噬菌体的溶菌生命周期242

4.噬菌体的溶源生命周期243

（1）若干有关的基本概念243

（2）溶源周期的主要特征244

（3）超感染免疫性245

（4）溶源噬菌体的诱发246

5.重组噬菌体的分离247

第二节 λ噬菌体载体248

1.λ噬菌体的分子生物学概述249

（1）λ噬菌体基因组的结构249

（2）λ噬菌体DNA的复制251

（3）λ噬菌体DNA的整合与删除251

（4）λ噬菌体DNA的转录与转译252

2.λ噬菌体载体的构建及其主要类型253

（1）构建λ噬菌体载体的基本原理253

（2）λ噬菌体载体的主要类型255

（3）凯伦噬菌体载体258

3.λ噬菌体载体的改良260

（1）Spi-正选择的λ噬菌体载体260

（2）具有体内删除特性的λ噬菌体载体262

4.λ重组体DNA分子的体外包装266

（1）λ重组体DNA分子的转染作用266

（2）λDNA的体外包装267

（3）λ噬菌体DNA的包装限制问题269

5.λ重组噬菌体的成熟269

6.λ重组体分子的选择方法270

（1）cl基因功能选择法270

（2）lacZ基因功能选择法270

（3）Spi-选择法271

7.克隆在λ噬菌体载体上的外源基因的表达271

第三节 柯斯质粒载体272

1.柯斯质粒载体的构建272

2.柯斯质粒载体的特点273

3.柯斯克隆274

4.柯斯克隆的改良276

（1）Ish-Horowicz-Burke柯斯克隆方案276

（2）Bates-swift柯斯克隆方案278

（3）其它的柯斯克隆方案279

第四节 单链DNA噬菌体载体280

1.M13噬菌体的生物学特性281

2.M13克隆体系284

（1）β半乳糖苷酶显色反应原理284

（2）M13载体系列的发展286

（3）M13载体系列的优点290

3.噬菌体展示载体293

第五节 噬菌粒载体296

1.噬菌粒载体的概念296

2.pUC118和pUC119噬菌粒载体297

（1） pUC118和pUC119噬菌粒载体的复制模式298

（2） pUC118和pUC119噬菌粒载体的优点299

（3） pUC118和pUC119噬菌粒载体的克隆程序301

3.pBluescript噬菌粒载体301

（1）体外转录载体301

（2） pBluescript噬菌粒载体的结构特征302

（3） pBluescript噬菌粒载体的体外转录303

第六章 基因的分离与鉴定305

第一节 DNA克隆片段的产生与分离308

1.基因组DNA的片段化308

（1）利用限制酶片段化基因组DNA的一般问题308

（2）基因组DNA的双酶消化策略309

2.DNA片段的大小分部309

3.编码目的基因的克隆片段的富集310

第二节 重组体DNA分子的构建及导人受体细胞310

1.外源DNA片段定同载体分子的重组312

（1）外源DNA片段定向插入载体分子312

（2）非互补粘性末端DNA分子间的边接312

（3）最佳连接反应314

2.重组体分子导入受体细胞的途径316

（1）重组体DNA分子的转化或转染317

（2）体外包装的λ噬菌体的转导318

第三节 基因克隆的实验方案319

1.互补作用基因克隆321

2.cDNA基因克隆322

（1）DNA文库的构建322

（2）不同车度mRNA的cDNA克隆327

（3）全长cDNA合成331

（4）cDNA克隆的优越性334

3.基因组DNA克隆335

（1）应用λ噬菌体裁体构建基因组文库336

（2）应用柯斯质粒载体构建基因组文库337

4.基因定位克隆340

（1）拟南芥菜简介341

（2）RFLP分子标记342

（3）RFLP作图的原理与步骤342

（4）染色体步移344

（5）大尺度基因组物理图谱的构建345

第四节 克隆基因的分离350

1.应用核酸探针分离克隆的目的基因352

（1）核酸探针的来源352

（2）寡核苷酸探针的人工合成353

（3）假阳性克隆的克服353

2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因356

（1）差别杂交356

（2）差别杂交的局限性358

（3）扣除杂交358

3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因359

（1） mRNA差别显示的原理361

（2） mRNA差别显示实验的基本过程362

（3） mRNA差别显示法的局限性362

4.应用表达文库分离克隆的目的基因364

5.酵母双杂交体系365

（1）酵母双杂交体系的基本原理365

（2）酵母双杂交体系的寄主菌株及质粒载体365

（3）酵母双杂交体系的实验程序368

第五节 重组体分子的选择与鉴定369

1.遗传检测法370

（1）根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法370

（2）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法374

2.物理检测法375

（1）凝胶电泳检测法375

（2）R-环检测法375

3.菌落或噬菌斑杂交筛选法375

4.免疫化学检测法376

（1）放射性抗体检测法378

（2）免疫沉淀检测法380

（3）表达载体产物之免疫化学检测法380

5.DNA-蛋白质筛选法382

6.转译筛选法382

（1）杂交抑制的转译382

（2）杂交选择的转译384

索引385