《表5 分离胶(12%)和浓缩胶(5%)的配制》

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《六溴环十二烷(HBCD)对H4细胞和SK-N-AS细胞脱碘酶2和3表达的影响》

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注:SDS表示十二烷基硫酸钠，APS表示过硫酸铵，TEMED表示N，N，N，N-四甲基乙二胺。

取生长对数期的SK-N-AS、H4细胞，调整细胞浓度为2×105个·m L-1，铺于10 cm的培养皿中，分别用0、1、3、9μmol·L-1HBCD处理24 h。（1）提取总蛋白及定量保存:用RIPA裂解液提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白定量，用蛋白变性剂及煮沸的方法使蛋白变性。（2）电泳分离蛋白及免疫印迹:按表5分别配制12%分离胶和5%浓缩胶，上40μg的蛋白样品。电泳条件为恒压100 V、90min；根据预染彩色蛋白分子量Maker，切取所需的蛋白凝胶，采用槽式湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，转膜条件为恒流220 m A、90 min。（3）封闭:5%脱脂奶粉封闭2 h。（4）孵育一抗:用1%的脱脂奶按1:400、1:200和1:1 000的比例分别稀释Dio2、Dio3和β-actin抗体，4℃孵育过夜。（5）孵育二抗:取一抗孵育的PVDF膜，摇床上TBST洗膜3×10min，用1%的脱脂奶按1:2 000、1:3 000分别稀释HRP标记的二抗，室温孵育2 h。（6）显影:用TBST洗膜3×10 min，按ECL检测试剂盒用UVP化学发光凝胶成像系统检测蛋白的相对表达量。