《表1 肺炎支原体及23S r RNA耐药突变位点结果判读标准》

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《台州地区儿童肺炎支原体感染及23S rRNA突变情况的多中心调查》

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（1） DNA提取，在咽拭子样本管中加入2 mL生理盐水，置于振荡器上使其充分混匀；取相应数量的2.5 mL离心管，将混匀的样品逐个加入其中，待高速离心（转速15 000 r/min，离心半径为12 cm）10 min后吸去上清液，同时保留底部细胞沉淀，将50μL裂解液和5μL内标液加入EP管中；EP管置于漩涡混合器上充分混匀，高温金属浴10 min（100℃）；待冷却至室温后又高速离心10 min，所得上清液即为DNA模板。（2）DNA扩增，上游引物序列:5′-AGGCTGAG-TACTGCCCAAGAG-3′，下游引物序列:5′-CAACTG-GAGCATAAGAGGTGT-3′。在生物安全柜中将提取的5μL DNA模板、5μL阴性对照和5μL质控品分别加入相应编号的反应液中，短暂离心后通过传递窗传递至扩增区。PCR参数:98℃，2 min；95℃，10 s；72℃，1 min，40个循环，64℃延伸10 min。荧光信号的收集定为FAM（2063或2064A∶G突变）、VIC（肺炎支原体）和CY5（内标），64℃延伸结束后，采集上一个循环的荧光信号。（3）结果判定:反应结束后，仪器自动保存结果（以Ct值显示）。Ct值20.00～25.00为强阳性对照的目的基因；Ct值29.00～34.00为弱阳性对照的目的基因；Ct值≤35.00为内标。采用FAM荧光指示23S rRNA耐药突变，采用VIC荧光指示肺炎支原体，结果判读标准见表1。