《表1 引物列表：鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区启动子活性鉴定与分析》

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《鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区启动子活性鉴定与分析》

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注：斜体表示保护碱基，下划线序列分别为SmaⅠ、KpnⅠ和SalⅠ酶切位点。SmaⅠ酶切位点为CCCGGG；KpnⅠ酶切位点为GG-TACC；SalⅠ酶切位点为GTCGAC。

根据鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区序列，利用Primer Premier 5.0设计引物。以AA肉鸡血液基因组DNA为模板，采用PCR扩增鸡miR-17-92基因簇上游的全长A/T富集区序列、A/T富集区5'端截短突变和3'端截短突变，引物信息见表1。将产物与克隆载体pEASY-T1 Simple Cloning Vector连接。双酶切、测序鉴定无误后，利用pGL3-basic vector构建全长A/T富集区和截短突变体的报告基因载体。PCR反应体系10μL:0.1μL Easy Taq DNA Polymerase，1μL 10×Easy Taq DNAPolymerase Buffer，0.8μL dNTPs，1μL基因组DNA模板，上下游引物各0.2μL，6.7μL ddH2O。PCR反应条件：95℃预变性5 min；经95℃30 s，退火55℃30 s，72℃延伸，共30个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。同时采用基因合成方法，将野生型A/T富集区报告基因载体pGL3-AT-MIR17-92（-1291/-577）的3个E2F1潜在结合位点CCGGGAAA（结合位点1）、CGGCAGAAAATGCGGGA（结合位点2）和ACGCCAAA（结合位点3）分别突变成Eco RⅠ酶切位点GGAATTCC，GGAATTCCAGGAATTCC及G GAATTCC，构建包含E2F1结合位点突变的报告基因载体pGL3-AT-MIR17-92-MUT1（结合位点1），pGL3-AT-MIR17-92-MUT2（结合位点2）和pGL3-AT-MIR17-92-MUT3（结合位点3）。采用双酶切、测序鉴定无误后用于后续分析。