《表1 ELP单体基因 (GVGVP) 5中密码子使用频率及重复次数》

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《温敏类弹性蛋白多肽的基因设计及重组克隆表达》

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注:使用频率表示每1 000个密码子中出现对应密码子的频率Note:Usage frequency represents the frequency of the correspon-ding codons in every 1 000 codons

为了实现重复多肽基因的无缝连接，需先对表达质粒pET-28a进行修饰。在pET-28a多克隆位点的XbaⅠ～Bam HⅠ区设计一段替换序列，合成两条可互补的单链寡核苷酸序列—F-28/R-28（表1），经过T4多聚核苷酸激酶的磷酸化和退火，形成具有XbaⅠ/Bam HⅠ黏性末端的双链DNA片段，与XbaⅠ/Bam HⅠ酶切后的pET-28a连接后转化至Top10中，涂布含卡那霉素的LB固体培养基过夜培养。以F-28/R-28作为引物进行菌落PCR，设定延伸时间为1 min，琼脂糖凝胶电泳结果显示泳道1～4在500～1 500 bp有相应的PCR产物，初步说明模板中含有可与F-28/R-28互补的序列（图1）。DNA测序结果进一步说明pET-28a的XbaⅠ～Bam HⅠ区被新的序列替换，引入了Ⅱs型限制性内切酶Bse RⅠ和AcuⅠ的识别位点，并且包括核糖体结合位点和起始密码子。修饰后的pET-28a保证了多肽基因翻译和表达的必要元件，同时引入的Ⅱs型限制性内切酶的识别位点便于下一步多肽基因的无缝插入，构建多肽基因库。