《表1 PCR引物序列及反应条件》

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《耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药分析及耐药基因和多位点序列分析》

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提取细菌DNA（加热煮沸法），PCR扩增5种碳青酶烯酶基因（blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48）。参照Gen Bank基因序列，Primer 5.0设计引物，Invitrogen公司合成（表1）。PCR反应体系（25μl）:3μl DNA模板，0.75μl上游引物、下游引物（10μmol/L），12.5μl Tag Mix，双蒸水补充至25μl。反应条件:94℃预变性2 min，94℃变性30 s，退火（54℃、53℃、52℃、56℃、52℃） 30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶（1%）电泳、染色、观察、测序（上海生物工程公司），并与Gen Bank已知序列比对，确定基因型。