《表1 KRAS,NRAS,BRAF PCR检测引物序列》

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《微卫星不稳定和RAS基因突变与Ⅲ～Ⅳ期大肠癌预后的相关性》

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突变分析：运用厦门艾德生物医药科技股份有限公司生产的人KRAS，NRAS和BRAF基因突变检测试剂盒，根据试剂盒说明书检测KRAS基因第2，3，4外显子上12种体细胞突变（G12D，G12A，G 1 2 C，G 1 2 V，G 1 2 S，G 1 3 D，Q 6 1 H，K 1 1 7 N，K 1 1 7 N，A 1 4 6 T，A 1 4 6 V，A 1 4 6 P），N R A S基因第2和3外显子上3种体细胞突变（G12D，Q61R，Q61K）和BRAF 15号外显子密码子600（V600E）基因突变。总反应体系均为35μL，其中包括模板DNA5μL，反应混合液30μL （KR AS/BR AF或NR AS PCR反应液，KRAS/BRAF或NRAS引物探针混合液，Ta q酶液）；每次反应均设置阳性、阴性对照及外控。所有的反应试剂均由此试剂盒提供。荧光定量PCR仪为SLAN-96 S Real-Time PCR仪。KRAS/B R A F或N R A S基因突变检测的P C R反应条件为95℃，5 min；95℃，25 s；64℃，20 s；72℃，2 0 s，共1 5个循环；9 3℃，2 5 s；6 0℃，3 5 s；72℃，20 s，共31个循环。反应结束后根据PCR仪说明书及荧光曲线的实际状况进行手动或自动调整基线和阈值，PCR仪即可得到各样本的突变Ct值，对照说明书判读KRAS/BRAF或NRAS基因突变情况。试剂盒中所用引物及探针序列见表1。