《表4 Real-time PCR引物探针序列》

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《血浆游离DNA Septin9基因甲基化检测方法》

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以第二代测序[又称高通量测序（next generation sequencing，NGS）]检测甲基化位点并分析其结果，针对高特异性的Cp G位点设计酶切甲基化引物探针。对Cp G位点序列进行甲基化敏感性酶切位点分析，酶切位点分析见表3；再根据酶切位点分析结果，设计Septin 9甲基化检测的引物探针序列。为监控非甲基化模板是否酶切完全，本研究根据GAPDH基因非甲基化存在2个Cp G酶切位点区域设计了引物探针，同时还设计内参基因ACTB的引物探针作为对照，序列见表4。将人CRC细胞系HCT116、正常结肠上皮细胞系NCM460、10%阳性细胞系核酸（10%人CRC细胞系HCT116核酸和90%正常结肠上皮细胞系NCM460核酸）、5%阳性细胞系核酸（5%人CRC细胞系HCT116核酸和95%正常结肠上皮细胞系NCM460核酸）、1%阳性细胞系核酸（1%人CRC细胞系HCT116核酸和99%正常结肠上皮细胞系NCM460核酸）加入Bst U1酶0.50μL，Hha I酶0.50μL，Hin P1I酶1.00μL，以及5×cutsmart缓冲液8.00μL，用40.00μL的上述细胞系（约50 ng）配置酶切反应体系，置于热循环仪中按照如下步骤进行酶切：37℃孵育1 h，65℃孵育1 h，85℃孵育15 min。取10.00μL酶切产物、10μmol/L Septin 9-M-F引物1.50μL，10μmol/L Septin 9-M-R引物1.50μL，10μmol/L Septin 9-M-FAM引物0.42μL，10μmol/L ACTB-M-F引物2.25μL，10μmol/L ACTB-M-R引物2.25μL，10μmol/L ACTB-M-HEX引物0.63μL，10μmol/L GAPDH-M-F引物1.20μL，10μmol/L GAPDH-M-R引物1.20μL，10μmol/L GAPDH-M-VIC引物0.85μL，用NF-H2O稀释，补足体积至50.00μL，将反应体系配置好后，置于ABI7500型real-time PCR测试仪中进行检测。分别统计相应比例细胞系核酸的Septin 9、ACTB和GAPDH的Ct值，评估相关体系的特异度和灵敏度。