《表2 Sec途径信号肽序列》

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《多铜氧化酶在大肠杆菌中的分泌表达》

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选择Omp T，Omp A，Pho A，Pel B和Mal E 5种大肠杆菌Sec途径信号肽，氨基酸序列如表2所示[23-25]。分泌表达MCOB重组质粒的构建方法如图1所示，以p ET28a（+）-MCOB为模板，用表3所示引物通过全质粒扩增分别将Omp T，Omp A，Pho A，Pel B和Mal E 5种信号肽融合到MCOB的N端。PCR反应体系为2x Primer STAR DNA聚合酶25μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA 1μL，dd H2O 22μL。PCR扩增条件为95℃预变性3 min；随后30个循环（95℃30 s，55℃30s，72℃7 min）；72℃补齐延伸10 min。PCR扩增产物经DpnⅠ处理1 h后柱回收，回收产物用Blunting Kination酶使其末端磷酸化，磷酸化产物用Soution I DNA连接酶连接，获得重组质粒p ET28a（+）-SP-MCOB（SP为5种信号肽之一），然后转化大肠杆菌BL21（DE3）获得菌株BL21（DE3）-p ET28a（+）-SP-MCOB。