《表1 CCMV蛋白表达条件优化L9(33）正交实验结果》

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《毕赤酵母分泌表达植物病毒蛋白制备自组装纳米催化剂提高催化性能》

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正交实验结果如表1所示。结果表明，影响重组毕赤酵母表达CCMV CPs的因素重要性依次为:诱导温度>诱导时间>甲醇终浓度。可见，本研究中温度的变化对毕赤酵母分泌蛋白影响最大。温度不仅影响自身的代谢水平，同时也间接影响到细胞老化和细胞对甲醇的利用。本研究中，P.pastoris CN15349-CP分泌衣壳蛋白的最佳诱导温度为30℃，与细胞生长温度接近。对酵母而言，超过30℃的高温，其自身细胞代谢受到抑制，细胞内醇氧化酶（AOX）活性和细胞能量水平下降，细胞死亡率增加，自身蛋白酶对所表达蛋白的降解性提高。这些都不利于外源蛋白的表达[45-48]。甲醇作为一种双功能试剂，既是P.pastoris细胞生长所需的碳源，也是外源蛋白表达的诱导剂。高浓度的甲醇，由于其细胞毒性会抑制细胞的生长，而低浓度的甲醇又会影响蛋白质的分泌表达[46，49]。因此，本研究中的最佳甲醇终浓度为质量分数0.9%。此浓度可以同时达到细胞生长和外源蛋白分泌的要求。随着培养时间的延长，培养基中的营养物不断消耗，产物不断积累，菌体也随之衰老，细胞分泌蛋白的能力持续下降。考虑成本和收率后，最佳诱导时间确定为96h。