《表1 引物列表Tab.1 List of primers》

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《基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞多模态示踪系统构建》

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注:下划线处表示限制性内切酶酶切位点.

首先，使用BsmBⅠ酶将sgRNA载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9进行酶切线性化，产生不同的黏性末端.根据酶切后的sgRNA载体的特点设计靶向序列引物AAVS1-sgRNA-F和AAVS1-sgRNA-R，由苏州金唯智生物公司合成，引物序列见表1.将sgRNA的上下游进行变性、退火（60μL体系:10μmol/L上下游引物各10μL+1.2μL 5mol/L NaCl，用去离子水定容到60μL；95℃，5min，自然冷却至室温）.用T4DNA连接酶将退火的sgRNA上下游引物和线性化的sgRNA载体连接（10μL体系:1μL退火产物+1μL sgRNA载体线性化产物+1μL T4DNA连接酶+1μL T4DNA连接酶缓冲液+6μL去离子水），4℃过夜.转化大肠杆菌感受态细胞Stbl3，Amp+平板筛选后，选取阳性克隆送去苏州金唯智生物有限公司测序，测序引物Human-U6，如表1所示.将测序正确的菌落37℃摇床过夜培养，离心后收集菌体，按质粒试剂盒说明书完成质粒提取.