《表2 斑节对虾性别鉴定方法的比较》

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《基于InDel标记的斑节对虾早期性别鉴定方法的建立》

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注：-.不能鉴别个体性别

目前对InDel的检测方法有杂交、PCR、分子构象、酶法等，并通过电泳、荧光、芯片、质谱分析等技术进行信号采集。对于单个InDel位点，电泳法和荧光PCR法较为常用。SYBR Green I染料是能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的双链DNA染料，与Taqman探针和饱和染料相比，具有价格低廉、重复性好的优点。SYBR Green I的实时荧光定量PCR检测方法在水产领域已有一定应用[35-36]。本研究前期共设计了9对扩增引物，每对引物均根据其最佳退火温度设置了高、中、低3个温度梯度，在综合考虑了测序和荧光定量结果后选择了该引物。此外，也尝试利用饱和染料进行HRM（Highresolution melting）分析，但其扩增效果欠佳，而使用SY-BR Green I染料能得到良好的扩增效果，故采用后者进行InDel标记的高通量检测。实践证明，本研究选择的InDel标记可以通过SYBR Green I实时荧光定量熔解曲线很好地区分，雌雄个体扩增产物在Tm值上的微小差别反映在熔解曲线上形成不同的熔解峰，其中雌性个体Tm值比雄性低0.65℃左右，在峰图上显示提前的熔解峰。在对斑节对虾亚成虾进行熔解曲线分析时，60个个体中有56个得到了可重复的结果，扩增成功率达到93.3%；这56个个体中有54个的判定结果与真实性别相同，吻合率达96.4%（图3），证明该方法的性别特异熔解曲线可以基本反映样品的真实性别。随后将该方法应用于不能通过外部观察分辨雌雄的早期个体（表2），在无节幼体Ⅵ和PL30期获得100%的扩增成功率和吻合率，说明该方法适用于早期个体的检测。但该方法在受精卵时期的扩增成功率为0，每一个样品的3个复孔均未能得到相同的熔解曲线，原因可能是本文的DNA提取方法不足以提取单个受精卵的DNA，下一步可尝试改进DNA提取方法；对于其他时期，除了溞状幼体的吻合率达89%，其他时期共70个样品，有60个得到可重复的结果，其中37个符合性别特异曲线的特征，吻合率仅61.7%，这可能与DNA提取方法或荧光染料有关，下一步可改进DNA提取方法或优化饱和染料使用条件。此外，本试验所用PL30个体体长为（1.11±0.09）cm，当个体达2 cm或更大时，即可通过提取游泳足DNA的方法检测个体性别，无需处死个体便可追踪个体的性别发育。本试验方法可对大量的样品进行高通量快速分析，且分析结束后的PCR产物仍可用测序方法验证雌雄，两种鉴别方法可相互印证，提高了检测的准确性。