《表3 TAIL-PCR反应参数》

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《文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析》

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以实验室保存的盛开期文心兰花瓣为材料，采用CTAB小量法提取花瓣DNA（石乐松和刘进平，2012）。采用TAIL-PCR方法克隆OnELF3基因的启动子。根据Liu和Whittier（1995）的方法设计4条随机引物：AD1、AD2、AD3和AD4（表2）。以实验室已获得的OnELF3基因的序列为基础，利用Primer 5设计3条特异的引物作为反向引物SP1、SP2和SP3。第一轮TAIL-PCR反应体系为：模板DNA 1μL；SP1及4个随机引物AD各0.5μL；10×LA BufferⅡ（Mg2+plus），5μL；d NTP Mix（2.5 mm each），8μL；TaKaRa LA Taq（5μm）0.25μL；总反应体系25μL。第二轮TAIL-PCR反应体系为：将第一轮PCR产物稀释10倍后取1μL为模板，SP2及4个随机引物AD各0.5μL；10×LA BufferⅡ（Mg2+plus），5μL；dNTP Mix（2.5 mm each），8μL；TaKaRa LA Taq（5μm）0.25μL；总反应体系25μL。第三轮TAIL-PCR反应体系为：将第二轮PCR产物稀释10倍后取1μL为模板，SP3及4个随机引物AD各0.5μL；10×LA BufferⅡ（Mg2+Plus），5μL；dNTP Mix（2.5 mm each），8μL；TaKaRa LA Taq（5μm）0.25μL；总反应体系25μL（表3）。