《表2 罕见缺失型--THAI/αα, --FIL/αα, --MED/αα, -α20.5/αα引物序列》

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《云南少数民族地区新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型研究》

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对Hb电泳HbBart′s≥0.1%且未检出常见α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失及非缺失标本，再行4种罕见缺失型--THAI/αα，--FIL/αα，--MED/αα，-α20.5/αα多重PCR检测。参照文献[4]设计引物，引物序列见表2。PCR反应体系包括:5μL 2×GC bufferⅠ、250μmol/L dNTP、正反向引物各0.16μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、15~25ng基因组DNA模板。PCR反应条件:96℃15min；随后98℃45s，60℃90s，保存或立即用2%琼脂糖凝胶电泳。对以上罕见缺失检测阴性的样本进行α1-珠蛋白基因和α2-珠蛋白基因的PCR扩增产物测序。从UCSC数据库（http://genome.ucsc.edu）中获取α-珠蛋白基因（α1-和α2-基因）的DNA序列。引物参照文献[5]，分别扩增α1-和α2-珠蛋白基因（包含3个外显子及部分上游和下游序列），引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列见表3。PCR扩增:α1-和α2-珠蛋白基因的PCR反应体系相同，总体积为50μL（包括:25μL 2×GC bufferⅠ、750μmol/L dNTP、正反向引物各6.4pmol/L、Taq DNA聚合酶2.0U、100ng基因组DNA模板）。扩增α1-珠蛋白基因的PCR反应条件:95℃5min；随后95℃40s，62.5℃40s，72℃100s，共35个循环；然后72℃3min；4℃保存。扩增α2-珠蛋白基因的PCR反应条件:95℃5 min；随后95℃40s，65℃40s，72℃100s，共35个循环；然后72℃3 min；4℃保存。PCR扩增完成后，先取2~3μL产物用2%琼脂糖凝胶电泳，确定成功扩增并获得特异性片段，将剩余PCR产物用于DNA测序。测序过程委托生工生物工程（上海）有限公司完成。用chromas及clustalx软件分析DNA测序结果。